Il tasso di crescita delle cellule è un processo regolato e un determinante fondamentale della fisiologia cellulare. Coltura continua utilizzando chemostati consente il controllo estrinseco di crescita cellulare mediante limitazione nutritiva facilitare lo studio delle reti molecolari che controllano la crescita cellulare e come tali reti evolvono per ottimizzare la crescita cellulare.
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Articolo metodologico
L'uso di chemostati in Biologia microbica Sistemi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule regolano il loro tasso di crescita in risposta a segnali dal mondo esterno. Con la crescita della cellula, diversi processi cellulari devono essere coordinati tra cui la sintesi macromolecolare, metabolismo e infine, l'impegno per il ciclo di divisione cellulare. Il chemostato, un metodo per controllare sperimentalmente tasso di crescita cellulare, fornisce un potente mezzo di sistematicamente studiare come impatti tasso di crescita processi cellulari - tra l'espressione genica e del metabolismo - e le reti di regolazione che controllano il tasso di crescita delle cellule. Quando mantenuta per centinaia di generazioni chemostati può essere usato per studiare l'evoluzione adattativa di microbi in condizioni ambientali che limitano la crescita cellulare. Descriviamo il principio di culture chemostato, dimostriamo loro funzionamento e fornire esempi delle loro varie applicazioni. Dopo un periodo di inattività dopo la loro introduzione a metà del XX secolo, la convergenza delle metodologie genoma scala con una rinnovata nelteresse nella regolazione della crescita cellulare e la base molecolare della evoluzione adattativa è stimolare una rinascita nell'uso di chemostati nella ricerca biologica.
Introduzione
La crescita delle cellule è regolata da complesse reti di interazione dei fattori genetici e ambientali 1,2. La regolazione multifattoriale della crescita cellulare richiede un approccio a livello di sistema allo studio. Tuttavia, lo studio rigoroso della crescita cellulare regolamentato è contestata dalla difficoltà di controllare sperimentalmente la velocità con cui le cellule crescono. Inoltre, anche nelle condizioni più semplici esperimenti extracellulari sono frequentemente dinamico e complesso come cellule alterano continuamente il loro ambiente mentre proliferano. Una soluzione a questi problemi è fornita dal chemostat: un metodo di coltura di cellu....
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Protocollo
Il principio di coltura continuo utilizzando un chemostat può essere realizzato in una varietà di implementazioni. In tutti chemostati è essenziale per avere 1) metodi per mantenere la sterilità di tutti i componenti, 2) una cultura ben miscelato, 3) aerazione adeguata del recipiente di coltura e 4) in modo affidabile Inoltre media e rimozione cultura. Qui, descriviamo l'uso di un bioreattore Sixfors (Infors Inc) come chemostat utilizzando metodi che possono essere facilmente adattato alle configurazioni alternative.
1. Montaggio delle navi chemostato
- Accendere i Sixfors utilizzando l'interruttore principale.
- ....
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Risultati
Uno dei principali vantaggi di chemostati è la capacità di controllare la velocità di crescita delle cellule sperimentalmente variando il grado di diluizione. Nel lievito erba, Saccharomyces cerevisiae, la morfologia di una cellula è informativo della fase del ciclo di divisione cellulare. Popolazioni con tassi di crescita contengono una percentuale maggiore di divisione attivamente cellule come determinato misurando la frazione di cellule unbudded (Figura 5A). Analisi di espressione mRNA globale di cul.......
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Discussione
Chemostati permettono la coltivazione di microbi in condizioni di steady-state di crescita controllata. Le cellule crescono continuamente ad una velocità costante risultante in un ambiente esterno invariante. Questo è in contrasto con i metodi di coltura batch in cui l'ambiente esterno è in continua evoluzione e il tasso di crescita delle cellule è determinata dalla complessa interazione di ambiente e genotipo. Pertanto, un vantaggio importante di coltura microbi in chemostati oltre colture in lotti è la capacità di.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da start up fondi dalla New York University. Ringraziamo Maitreya Dunham e Matt Brauer che ha inizialmente sviluppato l'uso di bioreattori Sixfors come chemostati.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Infors-HT Sixfors Chemostat | Risorse tecniche appropriate, Inc. | ||
| Bottiglia di vetro 9,5 L | Fisher Scientific | 02-887-1 | Per recipiente per media e |
| Fisher Scientific | 05-867 | Per tubo flessibile e tappo per tubi | |
| , misura 12, neoprene verde | Cole-Palmer | EW-62991-42 | Per tubo flessibile |
| e connettore diritto | Cole-Palmer | EW-30703-02 | Per media vessel e tubo |
| flessibile Generale fascette 4 in | Fisher Scientific | NC9557052 | per recipienti per fluidi e tubi flessibili |
| , B000FMWTDE in gomma siliconica | per recipienti e | ||
| tubi flessibili, silicone, 3/8 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1Q | per recipienti per fluidi e |
| tubi flessibili, silicone, 7/32 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1E | per recipienti per fluidi e tubi flessibili |
| Tubi, acciaio inossidabile, 3/16 pollici OD | McMaster-Carr | 6100K164 | Per recipienti per fluidi e tubi flessibili |
| , acciaio inossidabile, 3/8 pollici | McMaster-Carr | 6100K161 | Per recipienti per fluidi e connettori per ganci per tubi flessibili |
| Fisher | Scientific 14-66-18Q | Per recipiente per fluidi e tubo flessibile | |
| Morsetto a cricchetto | Cole-Palmer | EW-06403-11 | Per recipiente per fluidi e tubo flessibile |
| Luer, femmina | Cole-Palmer | EW-45512-34 | per recipiente multimediale e tubo |
| Luer, maschio | Cole-Palmer | EW-45513-04 | per recipiente multimediale e tubo flessibile |
| Millipore Aervent MTGR05010 filtro da 62 mm, 0,2 &; m | Fisher Scientific | MTGR05010 | per recipiente per media e tubi flessibili |
| PTFE Acrodisc CR 13 mm, 0,2 μ m | Fisher Scientific | NC9131037 | per recipiente per fluidi e tubi flessibili |
| Tubo di flusso a lettura diretta per aria | Cole-Palmer | EW-32047-77 | Per configurazione di azoto gassoso |
| Tubo di flusso a lettura diretta per azoto | Cole-Palmer | EW-32048-63 | Per configurazione di azoto gassoso |
| Dosatore di gas Telai multitubo | Cole-Palmer | EW-03218-50 | Per configurazione |
| di azoto gassosoRegolatore, analitico a due stadi | Airgas | Y12-N145D580 | per l'installazione del gas di azoto |
| Adattatore per tubo flessibile, acciaio inossidabile | Airgas | Y99-26450 | per l'installazione del gas di azoto |
| Adattatore maschio | Airgas | WES544 | per l'installazione dell'azoto gassoso |
| Tubi in norprene | US Plastics | 57280 | Per l'installazione dell'azoto Gas |
| Base per treppiede | Cole-Palmer | EW-03218-58 | Per l'impostazione dell'azoto gassoso |
| Cartucce per valvole | Cole-Palmer | EW-03217-92 | Per l'installazione dell'azoto gassoso |
| Damigiana 10 L | Fisher Scientific | 02-963-2A | Per la preparazione dei terreni |
| Filtri sterili per flaconi sottovuoto Steritop, 1.000 ml, membrana in PES; per collo da 45 mm | Fisher Scientific | SCGP-T10-RE | Per la preparazione dei terreni |
| Flacone per terreni da 100 ml, collo | da 45 mmFisher Scientific | FB-800-100 | per la preparazione dei terreni |
| cloruro di calcio· 2H2O | Fisher Scientific | C79-500 | Reagenti per terreni |
| Cloruro di sodio | Fisher Scientific | BP358-1 | Reagenti per terreni |
| solfato di magnesio· 7H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Reagenti per terreni |
| fosfato di potassio monobasico | Fisher Scientific | AC424205000 | Reagenti per terreni |
| solfato di ammonio | Fisher Scientific | AC423400010 | Reagenti per terreni |
| cloruro di potassio | Sigma Aldrich | P9541 | Reagenti per terreni |
| borico | Sigma Aldrich | B6768 | Reagenti per terreni |
| solfato di rame· 5H2O | Sigma Aldrich | 209198 Reagenti per terreni | |
| ioduro di potassio | Sigma Aldrich | 60400 | Reagenti |
| per terreni cloruro ferrico· 6H2O | Fisher Scientific | I88-100 | Reagenti per terreni |
| solfato di manganese· H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagenti |
| molibdato di sodio· 2H2O | Sigma Aldrich | M7634 | Reagenti per terreni |
| solfato di zinco· 7H2O | Fisher Scientific | Z68-500 | Reagenti per terreni |
| biotina Fisher | Scientific | BP232-1 | Reagenti per terreni |
| pantotenato di calcio | Fisher Scientific | AC24330-1000 | Reagenti |
| per terreni acido folico | Sigma Aldrich | F7876 | Reagenti |
| per terreni inositolo (noto anche come mio-inositolo) | Fisher Scientific | AC12226-1000 | Reagenti per terreni |
| niacina (alias acido nicotinico) | Sigma Aldrich | N4126 | Reagenti per terreni |
| acido p-aminobenzoico | Fisher | Scientific AC14621-2500 | Reagenti |
| per terreni piridossina HCl | Sigma Aldrich | P9755 | Reagenti |
| per terreni riboflavina | Sigma Aldrich | R4500-25G | Reagenti |
| per terreni tiamina HCl | Fisher Scientific | BP892-100 | Reagenti |
| per terreni Leucina | Sigma Aldrich | L8000-100G | Reagenti per terreni |
| Uracil | Sigma Aldrich | U0750 | Reagenti per terreni |
| Destrosio | Fisher Scientific | DF0155-08-5 | Reagenti per terreni |
Riferimenti
- Ingraham, J. L., Maaloe, O., Neidhardt, F. C. Growth of the Bacterial Cell. , Sinauer Associates, Inc. (1983).
- Cell Growth: Control of Cell Size. Hall, M. N., Raff, M. C., Thomas, G. , CSHL Press. (2004).
- Monod, J. La technique de culture continue, theorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, 390-410 (1950). <....
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Ristampe e permessi
