Generazione di linee cellulari umane stabili con tetraciclina-inducibile (Tet-on) shRNA o espressione di cDNA

Sommario

Un modo rapido e semplice per generare linee cellulari umane di inducibile e reversibile sovraespressione cDNA o shRNA-mediata knock-down del gene di interesse. Questo metodo consente ai ricercatori di linee cellulari altamente affidabile e riproducibile manipolare che sono difficili da modificare con metodi di trasfezione transiente o convenzionali atterramento / knockout strategie.

Abstract

Un approccio importante nel campo della biologia cellulare di mammifero è la manipolazione dell'espressione dei geni di interesse in linee cellulari selezionate, con lo scopo di rivelare una o più funzione del gene (s) con sovraespressione transiente / stabile o knockdown del gene di interesse. Purtroppo, per le indagini cellulari diversi biologici questo approccio non è adatto quando le manipolazioni del risultato dell'espressione genica in cellule di crescita / proliferazione difetti o differenziazione cellulare indesiderata. Pertanto, i ricercatori hanno adattato la proteina repressore tetraciclina (tetR), tratto dal E. coli resistenza alla tetraciclina operone ^1, per generare sistemi di regolazione molto efficienti e stretto per esprimere cDNA in cellule di mammifero ^2,3. In breve, tetR è stato modificato a uno (1) blocco di inizio trascrizione legandosi al Tet-operatore (TO) nel promotore per aggiunta di tetraciclina (Tet-off definito sistema) o (2) si legano al TO in tegli assenza di tetraciclina (Tet-definito sul sistema) (Figura 1). Data l'inconveniente che il Tet-off sistema richiede la presenza continua di tetraciclina (che ha una emivita di circa 24 ore in terreno di coltura cellulare tissutale) il Tet-il sistema è stato più ampiamente ottimizzata, con conseguente sviluppo di molto stretto ed efficienti sistemi vettore di espressione di cDNA come usato qui.

Poco dopo la creazione di RNA interference (RNAi) per atterramento gene in cellule di mammifero ^4, vettori che esprimono breve hairpin RNA (shRNA) sono stati descritti che funzione molto simile a siRNA ^5-11. Tuttavia, questi approcci shRNA-mediati atterramento presenta la stessa limitazione come strategie knockout convenzionali, in quanto l'esaurimento stabile non è fattibile se gli obiettivi di geni sono essenziali per la sopravvivenza cellulare. Per superare questa limitazione, van de Wetering et al ^12. Modificato l'espressione shRNA vettore pSUPER ⁵ Qui, si descrive un metodo per generare efficientemente umana stabile Tet-on linee cellulari che guidano affidabile iperespressione inducibile o deplezione del gene di interesse. Utilizzando questo metodo, siamo riusciti generato Tet-on linee cellulari che hanno notevolmente facilitato l'analisi del MST / hMOB / NDR cascata in centrosoma ^13,14 e apoptosi segnalazione ^15,16. In questo rapporto, descriviamo i nostri vettori di scelta, oltre a descrivere i due passaggi consecutivi di manipolazione che sono necessari per generare efficientemente umana Tet-on linee cellulari (Figura 2). Inoltre, oltre a delineare un protocollo per la generazione di umana Tet-on linee cellulari, discuteremo aspetti critici riguardanti le procedure tecniche e la caratterizzazione di cellule Tet-on.

Protocollo

1. Clonazione di pcDNA6_TetR_IRES_blast

1. Come illustrato in figura 3, eseguire un digest parziale del pcDNA6/TR plasmide (V1025-20, Invitrogen) con gli enzimi di restrizione Xba I e Nco I per rimuovere il gene tetR e il promotore della resistenza blasticidina (BlastR) gene. Isolare il vettore frammento di 4,6 kb.
2. Per rimuovere la sequenza di poliadenilazione del gene tetR, introdurre mediante PCR un sito Xho I subito dopo il codone di stop del cDNA tetR conservando il sito Xba I alla estremità 5 'del cDNA. Subclonare il frammento risultante in pMigR1 ¹⁷ usando enzimi di restrizion....

Risultati

Un esempio per la caratterizzazione di RPE-1 linee cellulari che esprimono stabilmente tetR è mostrato in Figura 4. Si noti che tutti i cloni RPE-1 esprimono diversi livelli di tetR (confronta corsie 2 e 5), mentre la linea cellulare parentale (che serve come controllo negativo) non esprime la proteina esogena tetR (Figura 4, corsia 1). Questa variazione nell'espressione tetR tra RPE-1 Tet-on cloni cellulari è previsto, poiché l'espressione del tetR esprimere plasmidi è altament.......

Discussione

Crediamo che Tet-sui sistemi facilitare notevolmente l'analisi della funzione genica, in particolare in sistemi cellulari che sono difficili da manipolare e / o quando il gene manipolato è essenziale per la sopravvivenza cellulare. Inoltre, la capacità di controllare l'espressione genica altamente specifici Tet-sui sistemi offre l'opportunità di studiare funzioni geniche in diverse fasi (per esempio durante la progressione del ciclo cellulare o ben definiti processi di differenziazione). Il metodo qui presen.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Siero bovino fetale (FBS)	Invitrogen	16000-044	Testato Tet-free
Blasticidina	Invivogen	ant-bl-1
Zeocin	Invivogen	ant-Zn-5
G418	PAA laboratori	P31-011	100 mg / ml in media
anti-TET02	Mobitec GmbH	TET02	Utilizzare a 1/1000 a 1/2000 per WB
pcDNA6/TR	Invitrogen	V1025-20
pT-Rex DEST30	Invitrogen	12301-016
Tetracycline	Sigma	87128	2 mg / ml in etanolo
Doxycycline	Sigma	D9891	2 mg / ml in acqua
Clonazione di cilindri	Bellco Glass Inc.	2090-00808	riutilizzabile