Generazione di linee cellulari umane stabili con tetraciclina-inducibile (Tet-on) shRNA o espressione di cDNA

Marta Gomez-Martinez; Debora Schmitz; Alexander Hergovich

doi:10.3791/50171

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Articolo metodologico

Generazione di linee cellulari umane stabili con tetraciclina-inducibile (Tet-on) shRNA o espressione di cDNA

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DOI:

10.3791/50171

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5 marzo 2013

Marta Gomez-Martinez¹ , Debora Schmitz² , Alexander Hergovich¹

¹UCL Cancer Institute, ²Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research

In questo articolo

Sommario

Un modo rapido e semplice per generare linee cellulari umane di inducibile e reversibile sovraespressione cDNA o shRNA-mediata knock-down del gene di interesse. Questo metodo consente ai ricercatori di linee cellulari altamente affidabile e riproducibile manipolare che sono difficili da modificare con metodi di trasfezione transiente o convenzionali atterramento / knockout strategie.

Abstract

Un approccio importante nel campo della biologia cellulare di mammifero è la manipolazione dell'espressione dei geni di interesse in linee cellulari selezionate, con lo scopo di rivelare una o più funzione del gene (s) con sovraespressione transiente / stabile o knockdown del gene di interesse. Purtroppo, per le indagini cellulari diversi biologici questo approccio non è adatto quando le manipolazioni del risultato dell'espressione genica in cellule di crescita / proliferazione difetti o differenziazione cellulare indesiderata. Pertanto, i ricercatori hanno adattato la proteina repressore tetraciclina (tetR), tratto dal E. coli resistenza alla tetraciclina operone ^1, per generare sistemi di regolazione molto efficienti e stretto per esprimere cDNA in cellule di mammifero ^2,3. In breve, tetR è stato modificato a uno (1) blocco di inizio trascrizione legandosi al Tet-operatore (TO) nel promotore per aggiunta di tetraciclina (Tet-off definito sistema) o (2) si legano al TO in tegli assenza di tetraciclina (Tet-definito sul sistema) (Figura 1). Data l'inconveniente che il Tet-off sistema richiede la presenza continua di tetraciclina (che ha una emivita di circa 24 ore in terreno di coltura cellulare tissutale) il Tet-il sistema è stato più ampiamente ottimizzata, con conseguente sviluppo di molto stretto ed efficienti sistemi vettore di espressione di cDNA come usato qui.

Poco dopo la creazione di RNA interference (RNAi) per atterramento gene in cellule di mammifero ^4, vettori che esprimono breve hairpin RNA (shRNA) sono stati descritti che funzione molto simile a siRNA ^5-11. Tuttavia, questi approcci shRNA-mediati atterramento presenta la stessa limitazione come strategie knockout convenzionali, in quanto l'esaurimento stabile non è fattibile se gli obiettivi di geni sono essenziali per la sopravvivenza cellulare. Per superare questa limitazione, van de Wetering et al ^12. Modificato l'espressione shRNA vettore pSUPER ⁵ Qui, si descrive un metodo per generare efficientemente umana stabile Tet-on linee cellulari che guidano affidabile iperespressione inducibile o deplezione del gene di interesse. Utilizzando questo metodo, siamo riusciti generato Tet-on linee cellulari che hanno notevolmente facilitato l'analisi del MST / hMOB / NDR cascata in centrosoma ^13,14 e apoptosi segnalazione ^15,16. In questo rapporto, descriviamo i nostri vettori di scelta, oltre a descrivere i due passaggi consecutivi di manipolazione che sono necessari per generare efficientemente umana Tet-on linee cellulari (Figura 2). Inoltre, oltre a delineare un protocollo per la generazione di umana Tet-on linee cellulari, discuteremo aspetti critici riguardanti le procedure tecniche e la caratterizzazione di cellule Tet-on.

Protocollo

1. Clonazione di pcDNA6_TetR_IRES_blast

Come illustrato in figura 3, eseguire un digest parziale del pcDNA6/TR plasmide (V1025-20, Invitrogen) con gli enzimi di restrizione Xba I e Nco I per rimuovere il gene tetR e il promotore della resistenza blasticidina (BlastR) gene. Isolare il vettore frammento di 4,6 kb.
Per rimuovere la sequenza di poliadenilazione del gene tetR, introdurre mediante PCR un sito Xho I subito dopo il codone di stop del cDNA tetR conservando il sito Xba I alla estremità 5 'del cDNA. Subclonare il frammento risultante in pMigR1 ¹⁷ usando enzimi di restrizione Xba I e Xho I per generare il plasmide pMigR1_TetR.
Digerire il vettore pMigR1_TetR con gli enzimi di restrizione Xba I e Nco I per liberare il frammento TetR_IRES. Isolare l'inserto 1,25 kb frammento.
Legare il 4,6 kb pcDNA6/TR e le 1,25 kb frammenti TetR_IRES. Transform il prodotto legatura in competente E.coli e identificare il costrutto pcDNA6_TetR_IRES_blast desiderato utilizzando le normali tecniche di biologia molecolare.

2. Generazione di linee cellulari che esprimono stabilmente tetR

Il giorno 1, Seed 1x10 ⁶ celle per 10 cm di piastra di coltura con il supporto di standard di crescita (ad es DMEM supplementato con 10% FCS). Seed due piastre, una per trasfezione con pcDNA6_TetR_IRES_blast, e l'altro come controllo negativo per la selezione blasticidina. Assicurarsi di utilizzare il passaggio più basso possibile e il mezzo di crescita consigliato.
Il giorno 2, transfect una piastra con 2 mg di pcDNA6_TetR_IRES_blast utilizzando Fugene 6 (E2691, Promega) seguendo le istruzioni del produttore. Non transfettare la seconda piastra.
Il giorno 3, aggiungere mezzo standard di crescita contenente 5 mg / ml blasticidina ad entrambe le lastre. Si prega di notare che la concentrazione scelta ottimale può variare per una linea cellulare, e di conseguenza potrebbe need da determinare in anticipo.
Il giorno 4, dividere le celle a 1/5, 1/25, 1/50 e 1/100 con 10 cm di piatti e terreno di coltura standard contenente 5 mg / ml blasticidina. Assicurarsi di etichettare correttamente piastre contenenti cellule non trasfettate o trasfettate. Preparare due piastre per fase di diluizione.
Controllare le cellule ogni giorno, in modo che tutte le celle sulle piastre non trasfettate sono morti entro la prima settimana. Modificare i media di selezione ogni 2-3 giorni.
Dopo 1-2 settimane, blasticidina resistenti colonie dovrebbe iniziare a comparire. Selezionare piastre contenenti 5-50 colonie per assicurare che singole colonie possono essere raccolti.
Quando le colonie hanno raggiunto un diametro di circa 5 mm (o maggiore), isolare almeno 12 cloni indipendenti utilizzando cilindri di clonazione per raccogliere singole colonie. Trasferire ciascun clone in un pozzo separato di una piastra a 24 pozzetti di coltura. Quando confluenti, dividere le cellule di ogni pozzetto in un singolo pozzetto di una piastra da 6 pozzetti di coltura.
Continuare a cl culturaquelli in mezzi di selezione. Quando confluenti, le cellule di ogni pozzetto divise in due singoli pozzetti di una piastra da 6 pozzetti di coltura.
Per ogni clone da testare, congelare un pozzetto di cellule confluenti e cellule raccolto nel pozzetto altro per le prove successive mediante immunoblotting.
Rileva tetR mediante Western blotting utilizzando l'anticorpo monoclonale murino anti-TET02 anticorpo (Mobitec GmbH). Di includere un lisato della linea cellulare parentale come controllo negativo.
Selezionare 3 cloni con l'espressione più alta tetR ed espandere ogni cultura clonale. Congelare le scorte di ciascun clone promettente appena possibile. Infine, esaminare i parametri molecolari e cellulari biologici di interesse confrontando le linee cellulari parentali con i tetR-cloni che esprimono. Selezionare il 'migliore' clone con l'espressione più alta tetR che non visualizza alcuna modifica nei parametri molecolari e biologiche delle cellule di interesse.

3. Test pilota di pter e pT-Rex DEST30 vettori EsprimiING shRNA o cDNA, rispettivamente,

Generare pter plasmide con inserti shRNA come descritto ^12. Costruire pT-Rex DEST30 vettore (12.301-016, Invitrogen) contenente il cDNA di interesse utilizzando la tecnologia Gateway (Invitrogen). In caso di espressione di cDNA, l'aggiunta di un tag al cDNA sarà poi facilitare l'individuazione di esogenamente proteina espressa.
Transitoriamente transfettare la linea cellulare parentale bersaglio con pter o pT-Rex DEST30 plasmidi (che ha espresso shRNAs o cDNA di interesse) con il reagente di trasfezione di scelta. Per il test di shRNA plasmidi di espressione, garantire elevate efficienze di trasfezione possono essere raggiunti.
Harvest cellule trasfettate e procedimenti per immunoblotting usando gli anticorpi appropriati, in attesa di rilevare un esaurimento o sovraespressione del gene di interesse.

4. Generazione di linee cellulari stabili con tetraciclina-inducibile (Tet-on) Espressione di shRNAs o cDNA utilizzando pter o pT-Rex DEST30 vettori

Il giorno 1, seme 1x10 ⁶ celle del 'migliore' tetR esprimono clone per 10 cm di lastra, con il supporto di standard di crescita integrato con certificato Tetracycline senza siero (ad esempio da FBS Invitrogen, 16000-014). Seme una piastra per la trasfezione con pter (o pT-Rex DEST30), e una piastra come controllo negativo per doppia selezione. Assicurarsi di utilizzare il più basso possibile passaggio.
Il giorno 2, transfect una piastra con 2 pg di pter (o pT-Rex DEST30) utilizzando Fugene 6. Non transfettare la seconda piastra.
Il giorno 3, aggiungere mezzo standard di crescita contenente 5 mg / ml blasticidina e 500 mcg / ml zeocin (o 1 mg / ml G418).
Il giorno 4, dividere le celle a 1/5, 1/25, 1/50 e 1/100 utilizzando piastre da 10 cm e terreno di coltura standard contenente 5 mg / ml di blasticidina e 500 pg / ml zeocin (o 1 mg / ml G418). Preparare due piastre per fase di diluizione.
Controllare le celle di tutti i giorni, facendo in modo che entro la prima settimana tutte le cellule sulle piastre non trasfettate sono morti.Cambia il mezzo standard di crescita contenente blasticidina e zeocin (o G418) ogni 3-4 giorni.
Dopo 2-3 settimane, blasticidina / zeocin (o blasticidin/G418) double-resistenti colonie dovrebbe iniziare a comparire. Selezionare piastre contenenti 5-50 colonie di scegliere singole colonie.
Quando le colonie hanno raggiunto un diametro di circa 5 mm (o maggiore), utilizzare cilindri di clonazione per raccogliere singole colonie. Isolare almeno 24 cloni individuali. Trasferire ciascun clone in un pozzo separato di una piastra a 24 pozzetti di coltura.
Cloni cultura in concentrazioni medie di manutenzione contenenti blasticidina (5 mg / ml) e zeocin (250 mcg / ml) [o G418 (0,5 mg / ml)]. Quando confluenti, dividere le cellule di ogni pozzetto in un singolo pozzetto di una piastra da 6 pozzetti di coltura.
Per ogni clone da testare, dividere un confluente pozzetto di una piastra da 6 pozzetti in tre singoli pozzetti di una piastra da 6 pozzetti. Quando confluenti, congelare le cellule da un pozzetto. Usare gli altri due pozzi per la verifica della tetraciclinae-inducibile espressione. Aggiungere tetraciclina alla concentrazione di 1 ug / ml ad un pozzetto, lasciando la tetraciclina secondo pozzo libero.
Dopo 24-96 ore di incubazione con le tetracicline, le cellule raccolto e di processo per immunoblotting utilizzando anticorpi appropriati. Brevi tempi di incubazione tetracicline sono raccomandati quando screening per l'induzione di espressione di cDNA, mentre più trattamenti tetraciclina sarà necessario determinare shRNA-mediata deplezione di proteine endogene.
Selezionare almeno due cloni con l'esaurimento desiderato / sovraespressione ed espandere ogni cultura. Congelare le scorte di ciascun clone promettente appena possibile. Quando cresce Tet-on cloni per gli esperimenti sempre assicurarsi di utilizzare supporti integrati con Tetracycline senza siero e gli antibiotici di selezione relativi a concentrazioni di manutenzione.