Optogenetic tecniche hanno permesso di studiare il contributo dei neuroni specifici comportamenti. Descriviamo un metodo in zebrafish larvale per l'attivazione di singoli neuroni somatosensoriali che esprimono una variante channelrhodopsin (Chef) con un diodo-pompato allo stato solido (DPSS) laser e registrare i comportamenti suscitate con una telecamera ad alta velocità video.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Attivazione Optogenetic di zebrafish neuroni somatosensoriali con Chef-tdTomato
In questo articolo
Sommario
Abstract
Zebrafish larvali stanno emergendo come modello per descrivere lo sviluppo e la funzione di semplici circuiti neurali. Grazie alla loro fecondazione esterna, rapido sviluppo, e la traslucenza, zebrafish sono particolarmente adatti per gli approcci optogenetic indagare funzione neurale circuito. In questo approccio, fotosensibili canali ionici sono espressi in neuroni specifici, consentendo lo sperimentatore per attivare o inibire a volontà e quindi valutare il loro contributo a specifici comportamenti. L'applicazione di questi metodi in zebrafish larvale è concettualmente semplice, ma richiede l'ottimizzazione dei dettagli tecnici. Qui mostriamo una procedura per esprimere una variante channelrhodopsin in larve di zebrafish neuroni somatosensoriali, singole cellule foto-attivazione, e la registrazione dei comportamenti che ne derivano. Introducendo alcune modifiche ai metodi precedentemente stabiliti, questo approccio può essere utilizzato per ottenere risposte comportamentali da singoli neuroni attivati finoad almeno 4 giorni dopo la fecondazione (DPF). In particolare, abbiamo creato un transgene con un neurone somatosensoriale enhancer, CREST3, per guidare l'espressione del tag channelrhodopsin variante, lo chef-tdTomato. Iniettando questo transgene in 1-cell risultati embrioni allo stadio di espressione mosaico nei neuroni somatosensoriali, che può essere ripreso con microscopia confocale. Illuminante identificato le cellule di questi animali con la luce di un laser 473 nm DPSS, guidati attraverso un cavo in fibra ottica, suscita comportamenti che possono essere registrati con una telecamera ad alta velocità e video analizzati quantitativamente. Questa tecnica potrebbe essere adattato per i comportamenti di studio suscitato attivando ogni neurone zebrafish. La combinazione di questo approccio con perturbazioni genetiche o farmacologici sarà un potente strumento per studiare la formazione di circuiti e la funzione.
Introduzione
Lo sviluppo di metodi optogenetic per promuovere o inibire l'eccitabilità neuronale con lunghezze d'onda definite di luce ha permesso di studiare la funzione di distinte popolazioni di neuroni nei circuiti neurali che controllano il comportamento 1, 19, 21. Questa tecnica viene spesso utilizzato per attivare gruppi di neuroni, ma può anche essere utilizzato per attivare i singoli neuroni. Larve Zebrafish sono particolarmente suscettibili di questi metodi in quanto sono trasparenti, il loro sistema nervoso si sviluppa rapidamente, e la creazione di animali transgenici è veloce e di routine. Tuttavia, notevoli ostacoli tecnici da superare per ottener....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Preparare la seguente prima del tempo.
1. Preparare Optic Cable
- Creare un contenitore per il cavo ottico fondendo il collo rastremata di una pipetta Pasteur di vetro su un becco Bunsen per creare un angolo di ~ 150 °.
- Utilizzando un cutter filo o una lametta, tagliare con cautela il cavo ottico in due pezzi. Ogni pezzo deve avere una estremità con un FC / adattatore PC ed una estremità esposta. Conservare un pezzo come un cavo di riserva.
- Spelare il cavo ottico verso il rivestimento rimuovendo la giacca fibre e le fibre di rinforzo (Figura 1A) da 5,0 centimetri di fine taglio del cavo. ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Figura 1. Cavo ottico impostato. (A) Livelli di un cavo in fibra ottica. (B) cavo in fibra ottica in Stripped una pipetta Pasteur. (C) del cavo in fibra ottica in pipetta Pasteur posizionata utilizzando un micromanipolatore.
Figura 2. Iniezione stampo m.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Abbiamo descritto un approccio per l'attivazione dei neuroni optogenetic RB singole in zebrafish vivo. Il nostro metodo utilizza transgenesi transitoria per esprimere una variante fluorescente tag channelrhodopsin, chef-tdTomato 13, in specifici neuroni somatosensoriali. Questo approccio potrebbe essere facilmente adattato per l'uso nelle popolazioni larvali zebrafish altre cellule.
Utilizzando questo approccio abbiamo costantemente suscitato risposte comportamentali 34-48.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario concorrente.
Ringraziamenti
Ringraziamo Fumi Kubo, Tod Thiele e HerwigBaier (UCSF / Max-Planck-Institut) per un parere sulla sperimentazione dei comportamenti e di laser DPSS impostati; Heesoo Kim e Chiara Cerri dal Corso di MBL Neurobiologia per l'assistenza nella Chef-tdTomato esperimenti; PetronellaKettunen (Università di Göteborg ) per la collaborazione iniziale di esperimenti optogenetic, BaljitKhakh, Eric Hudson, Mike Baca e John Milligan (UCLA) per un parere tecnico, e Roger Tsien (UCSD) per il cuoco-tdTomato costruire. Questo lavoro è stato supportato da una (5F31NS064817) premio NRSA a AMSP e una borsa di studio dalla NSF (RIG: 0.819.010) ad AS.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente / materiale | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| Materiale | |||
| Vetro pipetta Pasteur | Pescatore | 1367820B | o equivalente (10-15 mm di diametro) |
| 200 micron fibra ottica | Thorlabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch cord, Lunghezza: 3 m, Fine A: FC / PC, End B: FC / PC, Jacket: FT030 |
| Fibra da 50 micron ottica | Thorlabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch cord, Lunghezza: 3 m, Fine A: FC / PC, End B: FC / PC, Jacket: FT030 |
| Regolabile Stripping Tool | Thorlabs | AFS900 | o tre fori Stripping Tool (FTS4) |
| Diamante Wedge scriba | Thorlabs | S90W | |
| Flaming / Brown Micropipetta Puller | Sutter Instruments | P-97 | o equivalente |
| Tubi di vetro borosilicato con filamento | Sutter Instruments | BF-100-78-10 | |
| Iniezione stampo | n / a | n / a | Figura 5 |
| Centrifuga da 1,5 ml provette | Qualsiasi | Qualsiasi | |
| Petri (100x15 mm) | Qualsiasi | Qualsiasi | |
| Petri (60x15 mm) | Qualsiasi | Qualsiasi | |
| Pressione iniettore | ASI | MPPI-3 | o equivalente |
| Micromanipolatore e metallo cavalletto | Narashige | M152 | o equivalente |
| Pipette di plastica usa e getta | FISHERBRAND | 13-711-7 | o equivalente |
| Poker (supporto del perno e perno Insect) | Bene Scienza Strumenti, Inc. | 26018-17 e 26000-70 | o equivalente |
| Forcipe | Bene Scienza Strumenti, Inc. | 11255-20 | o equivalente |
| Microloader puntali per pipette | Eppendorf | 9300001007 | |
| 28.5 ° C incubatore | qualsiasi | qualsiasi | |
| 42 ° C di calore di blocco | Qualsiasi | Qualsiasi | |
| Lame di bisturi non sterili # 11 | Belle Strumenti Scientifici, Inc. | 10011-00 | o equivalente |
| Dissezione sfar fronte | Zeiss | Stemi | o equivalente |
| Fluorescente portata dissezione con filtro standard | Qualsiasi | qualsiasi | o equivalente |
| Microscopio confocale | Zeiss | LSM 510 o 710 | o obiettivi equivalenti con i laser per la GFP e RFP, e 10x, 20x e 40x |
| Ad alta velocità della fotocamera | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | o equivalente |
| 473 nm laser portatile | Cristallo laser | CL-473-050 | o potenza superiore, con opzione TTL |
| S48 Stimolatore | Astro-Med, Inc. Grass divisione strumento | S48K | o equivalente |
| FC / PC FC / PC manicotto di accoppiamento | Thorlabs | ADAFC1 | Maggio need per il collegamento del cavo ottico |
| Sicurezza laser Occhiali | Thorlabs | LG10 | o equivalente |
| 24 piastre di coltura | Genesee | 25-102 | o equivalente |
| Diapositive depressione singoli | Pescatore | S175201 | O equivalente |
| Reagente | |||
| Istantanea oceano | Ecosistemi acquatici | IS50 | |
| Blu di metilene | Pescatore | S71325 | |
| Rosso fenolo | Sigma | P4758 | |
| Agarosio | EMD | 2125 | o equivalente |
| Low Melt agarosio | Sigma | A9045 | o equivalente |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Tricaine | Sigma | A5040 | |
| blu acqua / embrione | 10 L DDH 2 O 0,6 g istantanea Ocean 6 gocce di blu di metilene | ||
| rosso fenolo | (5 mg / ml in 0,2 M KCl) | ||
| 100x PTU | 0,150 g PTU 50 ml DDH 2 O sciogliere a 70 ° C, agitare spesso aliquota e conservare a -20 ° C | ||
| 1x PTU | 1 ml 100x PTU 99 ml blu / pesci d'acqua | ||
| Tricaine soluzione stock | 400 mg tricaine 97,9 DDH 2 O | ||
| ~ 2,1 ml 1M Tris, pH9.0 | aggiustare il pH a ~ 7.0 negozio a 4 ° C o -20 ° C per una conservazione a lungo termine |
Riferimenti
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. Unidirectional start....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
