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Articolo metodologico

Extracellulare Identificazione neuroni motori per un pool di motore muscolare in

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⸱

DOI:

10.3791/50189

⸱

25 marzo 2013

 ,  , 
1Department of Biology, Case Western Reserve University , 2Department of Neurosciences, Case Western Reserve University , 3Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

In questo articolo

Sommario

Negli animali con grandi neuroni identificati ( Ad esempio, Molluschi), l'analisi delle piscine motore viene fatto utilizzando tecniche intracellulari 1,2,3,4. Recentemente, abbiamo sviluppato una tecnica per stimolare extracellulare e registrare i singoli neuroni in Aplysia californica 5. Descriviamo ora un protocollo per utilizzare questa tecnica per identificare e caratterizzare motoneuroni all'interno di un pool motore.

Abstract

Negli animali con grandi neuroni identificati (ad esempio molluschi), analisi di piscine motore viene fatto utilizzando tecniche intracellulari 1,2,3,4. Recentemente, abbiamo sviluppato una tecnica per stimolare extracellulare e registrare i singoli neuroni in Aplysia californica 5. Descriviamo ora un protocollo per utilizzare questa tecnica per identificare e caratterizzare motoneuroni all'interno di un pool motore.

Questa tecnica ha vantaggi extracellulare. Primi elettrodi extracellulari, può stimolare e registrare i neuroni attraverso la guaina 5, quindi non ha bisogno di essere rimosso. Così, i neuroni saranno più sani in esperimenti extracellulari che in quelli intracellulari. Secondo, se gangli sono ruotate di appropriate pinning della guaina, elettrodi extracellulari possono accedere neuroni su entrambi i lati del ganglio, che rende più facile e più efficace per identificare neuroni multipli nella stessa preparazione. In terzo luogo, extracellulareLAR elettrodi non devono penetrare nelle cellule, e quindi può essere facilmente spostato avanti e indietro tra neuroni, causando meno danni. Ciò è particolarmente utile quando si cerca di registrare i neuroni multipli durante ripetere schemi motori che possono persistere per qualche minuto. In quarto luogo, gli elettrodi extracellulari sono più flessibili di quelli intracellulari durante i movimenti muscolari. Elettrodi intracellulari può tirare fuori e danneggiare i neuroni durante le contrazioni muscolari. Al contrario, poiché elettrodi extracellulari pigiate delicatamente sulla guaina sopra neuroni, di solito soggiornare sopra il neurone stesso durante le contrazioni muscolari, e quindi può essere utilizzato in più preparazioni intatti.

Per identificare in modo univoco i neuroni motori per un parco macchine (in particolare, la I1/I3 muscolo in Aplysia) con elettrodi extracellulari, si possono usare le funzioni che non richiedono misure intracellulari come criteri: dimensione del soma e la posizione, la proiezione assonale, e innervazione muscolare 4, 6,7. Per la piscina particolare motore utilizzato per illustrare la tecnica, abbiamo registrato da nervi vestibolari 2 e 3 per misurare proiezioni assonali, e misurato le forze di contrazione del muscolo I1/I3 per determinare il modello di innervazione muscolare per i motoneuroni singoli.

Dimostriamo il processo completo della prima motoneuroni identificano con innervazione del muscolo, quindi caratterizzare la loro tempistica durante schemi motori, la creazione di un metodo semplificato diagnostico per l'identificazione rapida. Il metodo più semplice e rapida diagnosi è superiore per preparazioni più intatte, ad esempio nella preparazione massa sospesa buccale 8 o 9 in vivo. Questo processo può essere applicato anche in altri autoveicoli piscine 10,11,12 in Aplysia o in altri sistemi animali 2,3,13,14.

Protocollo

1. Preparazione del piatto di registrazione

  1. Durante gli esperimenti dei trasduttori di forza, i gangli buccale, ganglio cerebrale, e la massa buccale sono posti in un piatto tondo Pyrex che è specializzata per gli studi di forza.
  2. Per indurre ingestive-come modelli negli esperimenti, abbiamo bisogno di applicare la non idrolizzabile carbacolo agonista colinergico al ganglio cerebrale 15. Per evitare il contatto diretto carbacolo sul gangli buccale e massa buccale, camere separati per isolare il ganglio cerebrale dai gangli buccale e la massa buccale (Figura 1).
  3. Poiché la massa buccale è molto più spesso i gangli buccale, non sarà posto sullo stesso piano. Pertanto, questo piatto dovrebbe avere una camera posteriore del ganglio cerebrale (area A in figura 1), una piattaforma centrale per i gangli buccale (zona C in Figura 1), ed una camera anteriore più profonda per la massa buccale (area D in Figura 1).
  4. Per creare questo piatto, iniziare con un giro 100x15 Pyrex piatto (15 mm di altezza, 100 mm di diametro). Costruzione del piatto richiede versa diversi Sylgard. Seguire le istruzioni fornite con il prodotto Sylgard. Sylgard deve essere permesso di impostare diversi tra versa.
  5. La colata prima è creare il massimo livello di Sylgard nel piatto (zona B in Figura 1), che è il muro tra la piattaforma centrale e posteriore della camera.
  6. Utilizzare due supporti plastilina per isolare la zona per Sylgard parete (zona B in Figura 1). Rivestire le argilla supporti di modellazione di involucro di plastica dove potranno contattare la Sylgard per una più facile rimozione. Garantire guarnizioni di tenuta ai bordi, dove la plastilina si metterà in contatto il piatto, per ridurre la dispersione.
  7. Versare Sylgard nella porzione tra i due supporti di modellazione argilla quasi fino alla parte superiore del piatto. Lasciate che la Sylgard completamente configurato durante la notte. Mantenere il piatto in un luogo caldo può indurredefinizione più rapida. Rimuovere i supporti di creta per modellare e ripulire eventuali residui di creta sul Sylgard.
  8. Successivamente, la camera posteriore (area A in figura 1) e la piattaforma centrale (area C in figura 1) deve essere versato.
  9. Posizionare un supporto plastilina circa 5 mm dalla superficie frontale del Sylgard per la sezione della piattaforma centrale (zona C).
  10. Versare Sylgard nelle sezioni per la camera posteriore (area A) e piattaforma centrale (zona C) fino ad un'altezza di circa 3-5 mm al di sotto del livello superiore del primo Sylgard parete (zona B). La superficie Sylgard della camera posteriore dovrebbe essere leggermente inferiore a quella della piattaforma centrale per evitare la fuoriuscita dalla camera posteriore contenente carbacolo alla piattaforma centrale. Anche in questo caso, lasciare che il Sylgard completamente configurato durante la notte e quindi rimuovere il supporto plastilina.
  11. Il passo finale è quello di tagliare una tacca al centro della parete Sylgard per fornire un canale per le cerebrale-buccali connettivi (CBC) per andaretramite tra la piattaforma centrale e camera posteriore. La larghezza di questa tacca deve essere di circa 3-4 millimetri, che è abbastanza ampia per le CBC. Il fondo della tacca non deve essere inferiore alla superficie Sylgard della piattaforma centrale per evitare perdite. Una lama di bisturi può essere usato per tagliare la tacca.

2. Elettrodo Preparazione

  1. Tirare elettrodi di vetro extracellulari da singolo a canna capillare di vetro con un Flaming-Brown micropipetta estrattore come descritto da McManus et al. 8 nella sezione 3.1. Con il filamento FT345B nella estrattore, le nostre impostazioni del programma sono tipiche di calore 480, Pull 50, velocità 13, e ora 20, ma si noti che le impostazioni sarà diverso per i diversi filamenti. Questo programma crea gli elettrodi in una singola estrazione senza fuoco lucidatura stadio. La dimensione della punta dell'elettrodo dovrebbe essere inferiore alla dimensione dei corpi cellulari. Per i neuroni motori che vanno da 50 micron a 400 micron di diametro soma, il diamete internars degli elettrodi di vetro extracellulari dovrebbe essere di circa 40 pm e le loro resistenze dovrebbe essere di circa 0,1 MW quando sono pieni di Aplysia salina.
  2. Tirare elettrodi di aspirazione dal tubo di polietilene con un becco Bunsen. Tagliare un pezzo di tubo in polietilene circa 10 cm di lunghezza. Tenere il tubo su entrambe le estremità e metterlo molto vicino alla fiamma generata dal bruciatore Bunsen mentre si ruota il tubo fino a quando diventa morbida dal calore. Allungare il tubo con attenzione lungo la sua lunghezza, mentre allontanandolo dalla fiamma. La parte centrale del tubo sarà allungata e stretta come il tubo viene tirato.
  3. Tagliare il tubo a metà per formare due elettrodi di aspirazione. Elettrodi di aspirazione sono generalmente applicati alle estremità tagliate di nervi o ai muscoli, anche se a volte può essere applicato en passant.
  4. Creare elettrodi gancio per registrazioni nervose secondo il protocollo descritto da McManus et al 8 in sezioni 3,2-3,13. Questi elettrodi sono especialleato utile quando un nervo o muscolo non viene tagliato.

3. Hook elettrodo Allegato

  1. Sezionare l'animale e rimuovere la massa buccale seguendo il protocollo descritto in McManus et al. 8 sezione 4.
  2. Per la registrazione e la stimolazione, elettrodi gancio può essere attribuita ad una serie di nervi differenti.
  3. Per caratterizzare schemi come è stato fatto in vivo da Cullins Chiel e 9, le registrazioni devono essere ottenuti dal nervo I2 e muscolare che indica la fase protrazione di alimentazione 16, il nervo radular (RN) che indica la chiusura del cibo grasper 17, buccale nervo 2 (BN2) e del nervo vestibolare 3 (BN3) che indicano la fase di retrazione 17,18. Fissaggio degli elettrodi gancio segue una procedura simile a quella descritta da McManus et al 8, sezione 5.
  4. Le posizioni di questi nervi riferiscono alla schematica dell'apparato di alimentazione Aplysia mostrato nellaFigura 2 di 8 McManus et al. Si noti che i BN2 trifurcates in rami a, b, e c prima di andare sotto il muscolo I1 a scanalatura laterale. Un ramo è il primo ramo di separare dal tronco principale, ed è adiacente alla BN3.
  5. La nomenclatura dei rami a, b, c ed è stato utilizzato da Warman e Chiel 18. Rami a, b, e c corrispondono a rami 3, 2 e 1, rispettivamente, la nomenclatura usata da Nargeot et al. 19. Inoltre, la RN, il BN1, il BN2, e la BN3 corrispondono a nervi 1, 6, 5, 4 e, rispettivamente, nella nomenclatura usata da Kandel 20 e Scott et al. 21
  6. Per studiare l'innervazione del muscolo del muscolo I1/I3, ad eccezione di tutti i nervi nervi vestibolari 2 sarà separata dalla massa buccale durante gli esperimenti. Così, abbiamo utilizzato un elettrodo gancio per registrare dal BN2.
  7. Poiché il nervo I2 e l'RN non sarà collegato alla massa buccale, e sono molto difficili da accedere usando elettrodi gancio, è preferibile applicare elettrodi di aspirazione per registrare da loro invece. Noi descrivere l'applicazione di elettrodi di aspirazione nella sezione 7.
  8. Utilizzare un elettrodo gancio o un elettrodo di aspirazione per registrare dal BN3, perché è facile accedere utilizzando tipo di elettrodo. Abbiamo scelto di utilizzare un elettrodo gancio per le registrazioni BN3 ridurre al minimo il numero di manipolatori per mantenere gli elettrodi di aspirazione, e di risparmiare spazio per altri manipolatori o attrezzature.
  9. Collegare un elettrodo gancio al ramo di un BN2 (BN2-a) di avviare rifiuto-come modelli durante gli esperimenti. È utile per collegare un elettrodo aggiuntivo gancio al BN2-una dall'altra, perché alcuni neuroni rispondono differentemente alla ipsilaterale vs controlaterale BN2-una stimolazione.
  10. Per distinguere i neuroni con proiezioni unilaterali vs bilaterale,è utile anche per collegare gli elettrodi al gancio BN2 BN3 e dall'altro lato dei gangli buccale.

4. Gangli e preparazione muscolare

  1. I gangli buccale, ganglio cerebrale e massa buccale sarà preparato per gli esperimenti di trasduttori di forza, in cui il ganglio cerebrale è attaccato al gangli buccale tramite le CBC e la massa buccale è collegata ai gangli buccale tramite i BN2s soli.
  2. Dopo aver collegato gli elettrodi gancio, taglio del nervo vestibolare 1 (BN1) e il nervo esofageo (EN) bilaterale, il taglio nel punto di attacco alla massa buccale.
  3. Tirare il ganglio cerebrale in avanti per spostarlo fuori del modo del muscolo I2. Fare un taglio nel muscolo I2 sul sacco radular, estendere il taglio lateralmente e anteriormente, in entrambe le direzioni, e tirare il lembo del muscolo I2 in avanti per esporre il nervo radular. Tagliare i due rami RN e fare in modo che i rami sono abbastanza a lungo per il fissaggio di aspirazione elettrodi.
  4. Continue il taglio I2 in un ampio cerchio attorno alla gangli vestibolare, facendo attenzione a non tagliare i BN2s o le BN3s, fino a quando i gangli vestibolare e la parte del muscolo allegato I2 può essere completamente separato dalla massa buccale. Tagliare i BN3s bilaterali nel punto di attacco alla massa buccale, oltre l'allegato elettrodo gancio.
  5. Applicare uno strato sottile di grasso per vuoto per la tacca nel piatto prima descritta che collega la camera posteriore e la piattaforma di mezzo, con una punta di pipetta per raccogliere un poco di grasso per vuoto e stenderlo sopra la tacca.
  6. Applicare uno strato sottile di Quick-Gel super colla al fondo di vetro della camera anteriore, dove la massa buccale sarà posizionato, proprio di fronte alla base Sylgard della piattaforma centrale.
  7. Cura trasferire il ganglio cerebrale, gangli buccale e di massa buccale al piatto di registrazione (Figura 1) descritto al punto 2, facendo in modo che nessuno degli elettrodi gancio sono tirata, che potrebbe danneggiare i nervi.
  8. Posizionare accuratamente la massa buccale sulla colla nella camera anteriore del piatto di registrazione, per garantire che la superficie ventrale è incollato al fondo del piatto. Essere sicuri di mantenere i gangli e gli elettrodi di toccare la colla. Aggiungere Aplysia salina 8 (460 mM NaCl, 10 mM KCl, 22 mM MgCl2, 33 mM MgSO 4, 10 mM CaCl 2, 10 mM di glucosio, 10 mM MOPS, pH 7,4-7,5) al piatto, che indurrà la colla per impostare.
  9. Se il piatto deve essere trasferito in un altro microscopio per la preparazione del gangli vestibolare per le registrazioni extracellulari soma, essere molto attenti con gli elettrodi gancio. Gruppo elettrodi su un lato della massa buccale insieme, e anche del gruppo di elettrodi sul lato della massa buccale insieme. Afferrare con attenzione gli elettrodi afferrando il nastro laboratorio che copre i pin del connettore, ancora una volta facendo in modo che nessuno degli elettrodi sono tirata.
  10. Quando il piatto è posizionato sotto il microscopio, l'elettrodos deve essere drappeggiato con delicatezza sopra i lati del piatto e di riposo sulla piattaforma accanto al piatto.
  11. Durante le pause e tra le fasi dell'esperimento, aerare la soluzione salina nella camera di massa buccale con una pietra porosa acquario.
  12. Usare pinze per afferrare la guaina del ganglio cerebrale e tirarlo nella camera posteriore, assicurandosi che i CBC attraversano la tacca. Pin il ganglio cerebrale con altri nervi che i CBC per evitare di danneggiare le CBC intatte.
  13. Applicare grasso per vuoto più nel corso degli CBC, e quindi aggiungere soluzione fisiologica Aplysia di più per entrambe le camere del piatto, in modo che i gangli sono completamente sommerse. Assicurare che la parte superiore del grasso per vuoto è leggermente superiore alla parete Sylgard modo che colature tra le camere.
  14. Per stabilizzare i gangli buccale, primo perno di estremità dei BN3s, poi le BN1s e l'ENS sulla base Sylgard della piattaforma centrale (Figura 2). Poiché le BN3s verrà registrato con elettrodi gancios, i perni devono essere posizionati più distalmente rispetto ai punti di fissaggio degli elettrodi gancio.
  15. Utilizzare due perni, piegato a 90 gradi, come ganci per allungare e ancorare le CBC, in modo che le CBC non sarà danneggiato (Figura 2).
  16. Pin i rami RN tra la camera posteriore e la gangli vestibolare. Poi il muscolo I2 sarà sopra gli RN. Per esporre il nervo I2, utilizzare pinze per afferrare il muscolo I2 e tirarlo sopra i gangli vestibolare. Pin due angoli del muscolo I2 per evitare danni al nervo I2.
  17. Recidere il nervo I2 distale al punto in cui i due rami fondono nel muscolo I2. Assicurarsi che il muscolo è ancora innervato da essere paragonabile al vivo nelle registrazioni. Tagliare via il resto del muscolo I2 e capovolgere il nervo I2 posteriore e pin verso il basso tra i due rami RN (vedi figura 2, nel riquadro).
  18. Regolare le posizioni dei perni per allungare e aumentare la tensione, se un nervo è troppo lenta, o per rilasciare la tensione se un nerve è troppo stretto. Per stabilizzare ulteriormente l'gangli buccale, aggiungere ulteriori perni sulla guaina tra i nervi.
  19. Poiché i gangli buccale sono collocati fianco caudale up, ruotare i gangli buccale se i neuroni di interesse sono sul lato rostrale. Per ruotare uno dei due gangli vestibolare, utilizzare una pinza sottile da acchiappare guaina superiore al CBC, dove è vicino ai gangli vestibolare e il pin giù tra il BN2 e BN3. In alcuni gangli, può essere più conveniente di fissare il presente tra CBC e BN3.
  20. Aggiungere un ulteriore perno sulla guaina del ganglio vestibolare sul lato vicino alla camera anteriore per ridurre al minimo il movimento del ganglio vestibolare.
  21. Per tagliare la guaina che copre i gangli vestibolare, utilizzare una pinza sottile per afferrare la guaina sul lato vicino alla camera posteriore, quindi tagliare la guaina in eccesso con le forbici sottili senza esporre i corpi cellulari. Al fine di minimizzare i danni, rimuovere solo la quantità minima di guaina necessario vedere i corpi cellulari.
  22. Dopo tegli guaina dei gangli buccale viene tagliato, estrarre il nervo I2 e gli RN sul gangli buccale e bloccarli tra i gangli buccale e camera anteriore a ruotare ulteriormente gangli buccale. (Vedi figura 2).
  23. Per lavare ogni residuo di cloruro di magnesio, 8 che è stato utilizzato per anestetizzare l'animale prima della dissezione, sostituire la soluzione salina Aplysia nel piatto fresco con soluzione salina Aplysia.

5. Elettrico di collegamento elettrodi Hook

  1. Dopo i gangli e muscoli sono preparati, trasferire accuratamente il piatto al tavolo isolamento dalle vibrazioni per gli esperimenti.
  2. Collegare tutti gli elettrodi ai loro zoccoli sui cavi BNC che collegano agli amplificatori (AM amplificatore modello Sistemi 1700). Anche in questo caso, assicurarsi che gli elettrodi non sono tirata mentre si fa questo. Assicurarsi che gli elettrodi siano correttamente attaccati ai loro cavi appropriati e che le polarità siano corrette.

6. Impostare gli elettrodi di vetro extracellulari per Soma Recordings

  1. Riempire l'elettrodo con Aplysia salina utilizzando una siringa collegata ad un pezzo di tubo di polietilene di circa 15-20 cm. Collegare l'estremità libera del tubo di polietilene all'estremità dell'elettrodo di vetro. Tirare indietro lo stantuffo della siringa per riempire l'elettrodo con Aplysia soluzione salina.
  2. Posizionare l'elettrodo di vetro riempita extracellulare nella tacca del titolare del manipolatore. Utilizzare il manipolatore per posizionare la punta dell'elettrodo nella soluzione salina Aplysia contenente i gangli vestibolare.
  3. Inserire un argento / cloruro di argento filo saldato ad un pin connettore maschio oro nella elettrodo per servire come il filo di registrazione. Posizionare un altro argento / cloruro di argento filo saldato ad un pin connettore maschio oro direttamente nella salina Aplysia all'interno della sezione del piatto registrazione contenente i gangli buccale di agire come il filo di riferimento. Collegare sia the registrazione e fili di riferimento al cavo BNC che collega all'amplificatore.
  4. Se vi è spazio sufficiente per più manipolatori, ulteriori elettrodi in vetro extracellulari può essere aggiunto a registrare neuroni contemporaneamente.

7. Configurazione degli elettrodi di aspirazione per le registrazioni Nerve

  1. Tagliare l'estremità più stretta della punta dell'elettrodo di aspirazione in base al diametro del nervo. Il diametro interno della punta dell'elettrodo dovrebbe essere simile o leggermente inferiore al diametro del nervo garantire aspirazione stretto.
  2. Poiché il nervo I2 e l'RN sono molto vicini l'uno all'altro, i loro elettrodi possono essere ritenute dal manipolatore stesso per risparmiare spazio. Mettere due elettrodi in due tacche dello stesso titolare. Ruotare i due elettrodi e di garantire che i loro suggerimenti sono vicini gli uni agli altri. Scegliere uno di loro per la registrazione I2 nervo, l'altra per la registrazione RN.
  3. Posizionare la punta dell'elettrodo nella soluzione salina Aplysia all'interno del Recording piatto contenente i gangli vestibolare. Collegare l'estremità libera del tubo di polietilene sulla siringa per l'elettrodo di aspirazione. Utilizzare la siringa per riempire l'elettrodo con Aplysia salina. Spostare la punta dell'elettrodo in prossimità dell'estremità del nervo target, ossia il nervo I2, e usare la siringa per aspirare il nervo nell'elettrodo. La lunghezza del nervo all'interno dell'elettrodo dovrebbe essere di circa 0,5-1,0 mm per garantire una tenuta ermetica.
  4. Ripetere l'aspirazione per l'elettrodo che verrà collegata alla RN.
  5. Collegare gli elettrodi ai cavi BNC corrispondenti come descritto nel paragrafo 6.3.

8. Impostazione del trasduttore di forza per misurare l'I1/I3 contrazione muscolare

  1. Per collegare i trasduttori di forza al muscolo, utilizzare suture di seta. Piegare l'ago curvo di ogni sutura, e legare la sutura al trasduttore di forza. Afferrare e sollevare delicatamente una piccola quantità di muscoli con una pinza e, tenendo l'ago in un altro set di pinze, inserirel'ago attraverso il muscolo fino al punto piegato in dell'ago (Figura 1).
  2. Trasduttori può essere attaccata dorsalmente o lateralmente sul muscolo I1/I3. Attacco dorsale permette di misurare contrazioni evocate dall'attivazione il lato sinistro o destro del muscolo. Attacco laterale mostrerà forti forze per la maggior parte dei neuroni, ma consente solo la misurazione della contrazione sul lato a cui è attaccato il trasduttore.
  3. Per identificare i neuroni che può attivare le regioni anteriore, posteriore o entrambi di I1/I3, collegare un trasduttore di forza per la parte posteriore del muscolo, appena anteriormente al tessuto faringea, e collegare un altro trasduttore di forza per la parte anteriore del muscolare, le ganasce (Figura 1; ganci nota).
  4. Sollevare i trasduttori di forza fino a quando i punti di sutura sono tesa, ma non sforzatevi. Per verificare questo, visualizzare la misura del trasduttore di forza quando la sutura ha un certo gioco in it, e quindi sollevare il trasduttore fino a quando la misura è leggermente al di sopra di questo livello di base.

9. Identificare i neuroni motori all'interno di un parco macchine

  1. Questo protocollo descrive un processo per l'identificazione extracellularmente motoneuroni all'interno di un pool motore. Abbiamo utilizzato il software AxoGraph per monitorare l'attività dei singoli neuroni, nervi multipli e il muscolo (segnale EMG o forze di contrazione). In questo protocollo, abbiamo utilizzato le forze di contrazione del muscolo come illustrazione per il processo di identificazione di neuroni motori, in altri esperimenti, abbiamo utilizzato EMG come bene, e la configurazione di tali esperimenti è molto simile (vedi Discussione).
  2. Per individuare un neurone candidato, utilizzare il manipolatore per premere delicatamente la punta dell'elettrodo di vetro extracellulare giù sulla guaina sopra il centro del soma neurone 5 (Figura 3), che è la posizione migliore per la stimolazione e selettività registrazione 5. Poiché la corrente di soglia fo l'attivazione di un neurone aumenta linearmente con la distanza elettrodo e soma 5, la selettività della stimolazione diventa peggiore quando l'elettrodo viene spostato dal centro del neurone bersaglio verso un neurone adiacente.
  3. Per identificare un neurone motore, prima direttamente stimolare il neurone con l'elettrodo extracellulare di vetro per garantire che solo il neurone sta sparando, e deciderà se debba innerva il muscolo. Poi, extracellulare record da questo neurone di stabilire un uno-per-uno tra la registrazione soma extracellulare e le registrazioni del nervo, che è anche fondamentale per l'identificazione dei neuroni.
  4. Poiché la maggior parte amplificatori extracellulari non consentono stimolazione simultanea e la registrazione in un canale, impostare il canale utilizzato per stimolare e registrare il soma (il canale soma) alla modalità di stimolazione e di applicare una corrente anodica breve (ad esempio 6 msec per Aplysia neuroni 5) al soma (figure 4A, 5A, frecce nota 1 in entrambe le figure), partendo da una bassa corrente (ad esempio 200 μA), e aumentando gradualmente la corrente fino allo scoppio del neurone.
  5. Una volta che il neurone si attiva per scoppiare, si dovrebbe immediatamente cambiare il canale soma dalla modalità di stimolazione per la modalità di registrazione (figure 4A, 5A, frecce nota 2 in entrambe le figure). Tuttavia, ci saranno ancora ritardi tra la stimolazione soma e la registrazione a causa di ritardi di risposta umana.
  6. Se si aziona il neurone per un ragionevole lasso di tempo, dovrebbe essere possibile osservare uno-per-uno potenziali d'azione corrispondenti della registrazione soma e sul nervo (s) attraverso il quale i progetti dei neuroni (Figure 4B, 5B, linee tratteggiate nota ), nonché le forze generate dal neurone (figure 4A, 5A; scatole note blu). Se il neurone cottura arresta prima della registrazione soma inizia, aumentare la corrente di attivazione per un tempo più lungo.
  7. Il rapporto segnale-rumore del extracellulareregistrazioni dipende dalla posizione degli elettrodi e le dimensioni soma. La registrazione extracellulare diventerà più grande come l'aumento di dimensione soma e l'elettrodo a soma diminuire della distanza. Poiché il rumore varia solo in un intervallo ristretto, il rapporto segnale-rumore aumenterà anche all'aumentare della dimensione Soma e l'elettrodo a soma distanza diminuisce. Campo più comune del rapporto segnale-rumore è 4:01-08:01.
  8. I neuroni motori possono essere identificati in base alle loro caratteristiche, come la posizione soma, proiezione del nervo e innervazione del muscolo 4,6,7. Poiché solo i due BN2s sono collegati alla massa buccale, monitorando l'attività sui BN2s, si può assicurare che la forza di contrazione muscolare è causata solo dal neurone attivato dalla stimolazione extracellulare.
  9. Per esempio, B3 è un motoneurone grande per il muscolo I1/I3 (300-400 micron di diametro soma in animali di peso 200-350 grammi), situato sul lato rostrale del ganglio vestibolare (Figura 3 ). Si solo i progetti attraverso la omolaterale BN2, e innerva sia la parte anteriore e posteriore del muscolo I1/I3. La maggior parte del tempo, attivando genera un anteriore più grande di forza posteriore (8 su 9 esperimenti).
  10. Dopo un neurone è identificato, la sua attività può essere registrato in diversi alimenti come i comportamenti tramite l'elettrodo di vetro extracellulare (figure 4 e 5), che può essere provocato come descritto di seguito. La registrazione extracellulare sulla soma sarà molto più specifico di registrazioni nervose, che comprendono l'attività di molti neuroni differenti.
  11. Per indurre egestive-come programmi motori, stimolare BN2-a con 1-2 min di impulsi 19 (2 Hz, ogni impulso è 1 msec). Questa stimolazione genera affidabile modelli egestive in questa impostazione. Con una corrente sufficiente (ad esempio 300 μA), i modelli possono persistere per tutta la durata della stimolazione. A volte ci sarà un altro modello che si verifica poco dopola stimolazione è finita.
  12. Per indurre ingestive-come programmi motori, posizionare alcuni cristalli di carbacolo solida direttamente sulla guaina del ganglio cerebrale 15. Se si vuole controllare il livello di esposizione carbacolo, utilizzare una soluzione di 1 a 10 mM in carbacolo Aplysia salina. Concentrazioni maggiori hanno maggiori probabilità di indurre risposte. Motivi ripetitivi iniziano generalmente in cinque minuti, e può durare per circa dieci-quindici minuti prima di iniziare a correre giù.
  13. Dopo lavando carbacolo volte e in attesa per almeno 30 minuti, una successiva applicazione di carbacolo può essere aggiunto al ganglio cerebrale per indurre più ingestive simili schemi motori.
  14. Dopo motoneuroni più per la piscina motore particolare, sono state identificate e caratterizzate durante i programmi del motore, si può sviluppare un metodo molto semplificato diagnostica che richiede informazioni minime per la rapida identificazione di questi neuroni nel lavoro futuro (Figura 6 </ Strong>), ad esempio nella preparazione massa sospesa buccali o in vivo. I criteri possono includere soma dimensioni e la posizione, la proiezione del nervo, dimensioni dell'unità sui nervi, e la tempistica di attività durante schemi motori.

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Risultati

Le figure 4 e 5 mostrano i risultati tipici per identificare due I1/I3 motoneuroni. Figura 4 mostra le registrazioni soma di un grande motoneuroni, B3, durante schemi egestive-simili e ingestive-like (figure 4C, 4D). L'uno-per-uno picchi corrispondenti sul canale soma e il canale ipsilaterale BN2 (figura 4E) mostrano che la specificità di registrazione B3 soma è stata mantenuta durante modelli. B3 incendi durante il medio-tardiva fa...

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Discussione

Negli animali con grandi neuroni identificati, come molluschi (ad esempio, Lymnaea, Helix, e Aplysia), analisi di piscine motore è in genere fatto utilizzando la registrazione intracellulare 1,2,3,4. In questo protocollo, si descrive un processo per identificare univocamente i neuroni motori per un pool motore utilizzando una tecnica extracellulare. Abbiamo usato le misure di forza, come un esempio di questo processo. Si potrebbe anche usare EMG per misurare innervazioni muscolari. Brevement...

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Dichiarazioni

Non abbiamo nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni NIH e NSF NS047073 concessione DMS1010434.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome Azienda Numero di catalogo Commenti
Cloruro di sodio Fisher Scientific S671 Biologica, certificata
Cloruro di potassio Fisher Scientific P217 Certificato ACS
Magnesio cloruro esaidrato Acros Organics 19753 99%
Solfato di magnesio eptaidrato Fisher Scientific M63 Certificato ACS
Cloruro di calcio diidrato Fisher Scientifica C79 Certificato ACS
Glucosio (destrosio) Sigma-Aldrich G7528 BioXtra
MOPS buffer Acros Organics 17263 99%
Carbacolo Acros Organics 10824 99%
Soda caustica Fisher Scientific SS255 Certificato
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Riferimenti

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