Marcatura metabolica di RNA recentemente trascritto per Alta Risoluzione profili di espressione genica di RNA di sintesi, trattamento e Decay in coltura cellulare

Sommario

L'RNA cellulare totale fornisce un modello povero per studiare variazioni a breve termine in sintesi dell'RNA e il decadimento nonché la cinetica di RNA processing. Qui, descriviamo marcatura metabolica di RNA trascritto recente con 4 thiouridine seguito da biotinylation tiolo-specifica e purificazione dell'RNA trascritto appena consentano di superare queste limitazioni.

Abstract

Lo sviluppo di microarrays intero trascrittoma e sequenziamento di nuova generazione ha rivoluzionato la nostra comprensione della complessità di espressione genica cellulare. Insieme a una migliore comprensione dei meccanismi molecolari coinvolti, misure precise della cinetica sottostanti sono diventati sempre più importanti. Qui, questi potenti metodologie incontrano notevoli limitazioni dovute alle proprietà intrinseche dei campioni template studiano, cioè RNA cellulare totale. In molti casi cambiamenti RNA cellulare totale verificano o troppo lentamente o troppo velocemente per rappresentare gli eventi molecolari sottostanti e la loro cinetica con risoluzione sufficiente. Inoltre, il contributo delle alterazioni della sintesi dell'RNA, elaborazione e decadimento non sono facilmente differenziate.

Recentemente abbiamo sviluppato ad alta risoluzione-profili di espressione genica di superare queste limitazioni. Il nostro approccio si basa sulla marcatura metabolica di nuova RNA trascritto con 4 thiouridine (quindi anche denominato 4SU-tagging) seguita da una rigorosa purificazione dell'RNA trascritto recente utilizzando biotinylation tiolo-specifici e biglie magnetiche rivestite di streptavidina. È applicabile ad una vasta gamma di organismi vertebrati, compresi Drosophila e lieviti. Abbiamo applicato con successo 4SU-tagging per studiare la cinetica in tempo reale delle attività di fattore di trascrizione, di fornire misure precise di RNA emivita, e ottenere nuove informazioni sulle cinetiche di trasformazione dell'RNA. Infine, modellazione computazionale può essere impiegato per generare un, analisi completa integrata dei meccanismi molecolari sottostanti.

Introduzione

Profili di espressione genica è uno strumento chiave utilizzata per lo studio dei processi cellulari e la rete associata complessa interazione. Studi su mRNA abbondanza sono stati in genere il metodo di scelta per ottenere intuizioni fondamentali sui meccanismi molecolari sottostanti. Lo sviluppo di microarrays intero ^{trascrittoma-1} e, più recentemente, di sequenziamento di nuova generazione di RNA (RNA-Seq) ^2-4 alimentato questo approccio. Mentre queste tecnologie hanno rivoluzionato la nostra comprensione della complessità di espressione genica cellulare, si trovano ad affrontare gravi limitazioni dovute alle proprietà intrinseche delle loro c....

Protocollo

1. Marcatura metabolica con 4 thiouridine

Fare un piano dettagliato del setup sperimentale / programma, ad esempio, quando aggiungere il 4SU di coltura cellulare e quando raccogliere i campioni. Piano per almeno 5 minuti tra ogni condizione. Solo il trattamento di cellule di una condizione alla volta. Maneggiare max. 3-5 piatti in un dato momento. Maneggiare le cellule più rapidamente possibile per ridurre al minimo i cambiamenti di temperatura e livelli di CO _2. Evitare di esporre le cellule alla luce dopo 4SU viene aggiunto in quanto ciò potrebbe causare la reticolazione di RNA 4SU-etichettati per le proteine ​​cellula....

Risultati

1. Materiale di partenza e di rendimenti attesi

A seguito di 1 ora (ora) di 4SU-esposizione appena trascritto RNA rappresenta circa il 1-4% del totale RNA cellulare. Questa sarà la più bassa in cellule di crescita-arrestati in quanto sintetizzano più RNA per conto per la crescita cellulare / replica. Quando l'etichettatura per 1 ora, si consiglia di iniziare il test con 60 - 80 mg di RNA totale. Partendo con meno di 30 microgrammi di RNA totale risultati in piccoli pellet di RNA che sono di.......

Discussione

Marcatura metabolica di nuova trascritto RNA aumenta sensibilmente la potenza delle tecnologie high-throughput, come microarrays e RNA-Seq fornendo modelli più adeguati per affrontare la questione biologica di interesse. Il presente protocollo ha subito ottimizzazione vasta. Permette> 1.000 volte arricchimento di RNA appena trascritto e fornisce risultati altamente riproducibili.

Il disegno sperimentale di un esperimento 4SU-tagging è di importanza cruciale come RNA trascritto appena si r.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
4-tiouridina	Carbosynth	T4509	Preparare 50 mM di stock in H2O, conservare a -20 ° C in aliquote da 50-500 μ l, gettare il reagente non utilizzato, non ricongelare.
Trizol	Invitrogen	15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)	AVVERTENZA - CORROSIVO e PERICOLOSO PER LA SALUTE! Garantire l'accesso immediato all'antidoto fenolico (PEG-Metanolo); Conservare a 4 °C.
Cloroformio	Sigma	372978	AVVERTENZA - PERICOLOSO PER LA SALUTE
Isopropanolo	Sigma	650447
Citrato di sodio, senza nucleasi	Sigma	C8532	Preparare una soluzione madre 1,6 M utilizzando acqua priva di nucleasi.
5M NaCl Sigma		71386	Soluzione madre
H2O senza nucleasi	Sigma	W4502	Produrre aliquote da 1 ml in provette prive di nucleasi.
		di precipitazione dell'RNA	1,2 M NaCl, 0,8 M citrato di sodio in acqua priva di nucleasi. Preparare in anticipo in condizioni rigorosamente prive di nucleasi. Conservare a temperatura ambiente in provette falcon da 50 ml.
Etanolo	Sigma	459844	Utilizzare con acqua priva di nucleasi per preparare etanolo all'80%, conservare a -20 °C.
1 M Tris Cl privo di nucleasi, pH 7,5	Lonza	51237	Soluzione madre
500 mM EDTA senza nucleasi, pH 8,0	Invitrogen	15575-020	Soluzione madre
10x Tampone di biotinilazione (BB)			100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA in acqua priva di nucleasi, fare aliquote da 1 ml.
Dimetilformammide (DMF)	Sigma	D4551
EZ-Link biotina-HPDP	Pierce	21341	Preparare 1 mg/ml di soluzione madre sciogliendo 50 mg di biotina-HPDP in 50 ml di DMF. Il riscaldamento delicato migliora la solubilizzazione. Conservare a 4 gradi C in aliquote da 1 ml.
Phase Lock Gel Heavy tubes 2,0 ml	Eppendorf	0032 005.152	Opzionale per la fase di estrazione del cloroformio.
Membrana Zeta	BIORAD	162-0153
10x Tampone			100 mM NaOH, 10 mM EDTA
Biotina-oligo			5'-biotina, 25 nucleotidi, qualsiasi sequenza
Sodio dodecil solfato	Fisher	BPE9738	Per 100 ml di soluzione madre al 20%, aggiungere 20 g di SDS a 80 ml di PBS pH 7-8 e regolare il volume a 100 ml. Mantenere tutte le soluzioni SDS ad alta percentuale al di sopra di 20 °C. Caldo le soluzioni leggermente dovrebbero precipitare SDS.
EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin	Pierce	21333	Preparare 1 mg/ml di soluzione madre sciogliendo 50 mg di iodoacetil-biotina in 50 ml di DMF. Il riscaldamento delicato migliora la solubilizzazione. Conservare a 4 gradi C in aliquote da 1 ml. Genera una biotinilazione irreversibile e specifica per i tioli.
Soluzione salina tampone fosfato	Gibco	10010-015
Tampone bloccante			Miscelare 20 ml 20% SDS con 20 ml 1 x PBS pH 7-8 e aggiungere EDTA alla concentrazione finale di 1 mM.
Streptavidina-rafano perossidasi	Vector Laboratories	SA5004	Conservare a -20 °C. Mescolare 10 ml 20% SDS con 10 ml 1 x PBS. Aggiungi 20 μ l. Streptavidina-HRP prima dell'uso.
Reagente ECL	GE Healthcare	RNP2109	Utilizzare seguendo le istruzioni del produttore.
Pellicola Super RX, X-RA, 18x24 cm	Fujifilm	47410 19236
μ Macs Streptavidin Kit	Miltenyi	130-074-101	Conservare le perline a 4 °C.
Tween 20	Sigma	P1379
Tampone			100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,1% Tween 20 in H2O privo di nucleasi.
Ditiotreitolo (DTT)	Sigma	43817	Preparare come 100 mM di DTT in H2O senza nucleasi, preparare sempre fresco prima dell'uso.
RNeasy MinElute Kit	Qiagen	74204	Memorizza colonne a 4 gradi C, componenti rimanenti del kit a temperatura ambiente.
Provette in polipropilene con tappo a vite da 1,5 ml	Sarstedt	72.692.005	Compatibile con Dimetilformammide
Tubi in polipropilene con tappo a vite da 2,0 ml	Sarstedt	72.694.005	Compatibile con Dimetilformammide
Provette da 15 ml	BD Falcon	352096	Compatibile con Dimetilformammide
Provette da 50 ml	BD Falcon	352070	Compatibile con Dimetilformammide
Tutte le soluzioni/reagenti devono essere conservati a temperatura ambiente se non diversamente specificato.
Equipment
Spettrofotometro UV/VIS	Thermo Scientific	NanoDrop 1000	O equivalente. Utilizzare un volume basso (1-2 μ l) per misure di basse concentrazioni di RNA per evitare un'eccessiva perdita di campione.
Provette da centrifuga in polipropilene da 15 ml	VWR International	525-0153	A differenza delle provette standard da 15 ml, tollerano fino a 15.000 × g
Centrifuga ad alta velocità	Beckman Coulter	Avanti J-25	O apparecchiature equivalenti in grado di raggiungere i 13.000× g
Rotore ad alta velocità	Beckman Coulter	JLA-16250	O attrezzatura equivalente in grado di raggiungere 13.000× g
Adattatori per provette da 15 ml	Laborgerä te Beranek	356964	O apparecchiature equivalenti in grado di raggiungere 13.000× g
Centrifuga da tavolo refrigerata	Eppendorf	5430 R	O equivalente.
Thermomixer	Eppendorf	Thermomixer compact	O equivalente.
Supporto magnetico	Miltenyi Biotec	130-042-109	Un supporto contiene 8 persone μ Colonne Mac.
Concessione per bagnomaria		SUB Aqua 5	o equivalente.
Scala ultrafine	A& D	GR-202	O equivalente.
E-Gel iBase Power System	Invitrogen	G6400UK	Per gel di RNA; o equivalente.
E-Gel EX 1% agarosio gel prefabbricati	Invitrogen	G4020-01	Per gel di RNA; o equivalente.

senza nucleasi Tampone legante il dot blot dot blot di lavaggio