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Articolo metodologico

Marcatura metabolica di RNA recentemente trascritto per Alta Risoluzione profili di espressione genica di RNA di sintesi, trattamento e Decay in coltura cellulare

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DOI:

10.3791/50195

⸱

8 agosto 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Max von Pettenkofer Institute, 2Department of Medicine, University of Cambridge, 3Institute for Informatics, Ludwig-Maximilians-University Munich

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

L'RNA cellulare totale fornisce un modello povero per studiare variazioni a breve termine in sintesi dell'RNA e il decadimento nonché la cinetica di RNA processing. Qui, descriviamo marcatura metabolica di RNA trascritto recente con 4 thiouridine seguito da biotinylation tiolo-specifica e purificazione dell'RNA trascritto appena consentano di superare queste limitazioni.

Abstract

Lo sviluppo di microarrays intero trascrittoma e sequenziamento di nuova generazione ha rivoluzionato la nostra comprensione della complessità di espressione genica cellulare. Insieme a una migliore comprensione dei meccanismi molecolari coinvolti, misure precise della cinetica sottostanti sono diventati sempre più importanti. Qui, questi potenti metodologie incontrano notevoli limitazioni dovute alle proprietà intrinseche dei campioni template studiano, cioè RNA cellulare totale. In molti casi cambiamenti RNA cellulare totale verificano o troppo lentamente o troppo velocemente per rappresentare gli eventi molecolari sottostanti e la loro cinetica con risoluzione sufficiente. Inoltre, il contributo delle alterazioni della sintesi dell'RNA, elaborazione e decadimento non sono facilmente differenziate.

Recentemente abbiamo sviluppato ad alta risoluzione-profili di espressione genica di superare queste limitazioni. Il nostro approccio si basa sulla marcatura metabolica di nuova RNA trascritto con 4 thiouridine (quindi anche denominato 4SU-tagging) seguita da una rigorosa purificazione dell'RNA trascritto recente utilizzando biotinylation tiolo-specifici e biglie magnetiche rivestite di streptavidina. È applicabile ad una vasta gamma di organismi vertebrati, compresi Drosophila e lieviti. Abbiamo applicato con successo 4SU-tagging per studiare la cinetica in tempo reale delle attività di fattore di trascrizione, di fornire misure precise di RNA emivita, e ottenere nuove informazioni sulle cinetiche di trasformazione dell'RNA. Infine, modellazione computazionale può essere impiegato per generare un, analisi completa integrata dei meccanismi molecolari sottostanti.

Introduzione

Profili di espressione genica è uno strumento chiave utilizzata per lo studio dei processi cellulari e la rete associata complessa interazione. Studi su mRNA abbondanza sono stati in genere il metodo di scelta per ottenere intuizioni fondamentali sui meccanismi molecolari sottostanti. Lo sviluppo di microarrays intero trascrittoma-1 e, più recentemente, di sequenziamento di nuova generazione di RNA (RNA-Seq) 2-4 alimentato questo approccio. Mentre queste tecnologie hanno rivoluzionato la nostra comprensione della complessità di espressione genica cellulare, si trovano ad affrontare gravi limitazioni dovute alle proprietà intrinseche delle loro campione modello, cioè RNA cellulare totale. In primo luogo, i cambiamenti a breve termine dei livelli totali di RNA non corrispondono a variazioni dei tassi di trascrizione, ma sono intrinsecamente dipendente dalla RNA emivita delle rispettive trascrizioni. Mentre un quintuplo induzione di un trascritto di breve durata, per esempio codifica per un fattore di trascrizione, sarà prontamente rilevabile in RNA totaleentro un'ora, la stessa induzione di una trascrizione vita lunga, ad esempio la codifica per un enzima metabolico, rimane praticamente invisibile. Inoltre, anche un completo spegnimento (> 1.000 volte down-regulation) del tasso di trascrizione di un gene medio con un RNA emivita di cinque ore sarà semplicemente prendere cinque ore per i suoi livelli di RNA totale di diminuire solo del duplice . Pertanto, l'analisi di RNA totale favorisce l'individuazione di up-regolazione di trascritti di breve durata, molti dei quali codificano per fattori di trascrizione e geni con funzioni regolatrici 5. Inoltre, la vera cascata cinetica di regolazione è oscurata e segnalazione di eventi primari non può essere differenziata da secondario. Entrambi, a loro volta, possono generare una distorsione nella valle analisi bioinformatica. In secondo luogo, alterazioni nei livelli totali di RNA non può essere attribuito a cambiamenti nella sintesi di RNA o di decadenza. Misurazioni di quest'ultimo richiedono approcci invasivi cellule, ad esempio bloccanti trascrizionisull'uso actinomicina D 6, e il monitoraggio prolungato di continuo decadimento RNA nel tempo. Con un mRNA emivita media nelle cellule di mammifero di 5-10 ore 5,7, i livelli di mRNA della maggior parte dei geni saranno solo sono diminuiti di meno di due volte a seguito di diverse ore di arresto trascrizionale. Piuttosto queste piccole differenze determinare misurazioni grossolanamente imprecise di mRNA emivite per la maggioranza dei geni cellulari a causa della natura esponenziale delle equazioni matematiche sottostanti. Infine, mentre l'RNA-Seq di RNA cellulare totale ha rivelato che circa la metà dei nostri geni sono soggetti ad eventi alternative splicing 8, la cinetica di fondo, nonché i meccanismi dinamici che guidano tessuto e contesto-specifica regolamentazione del trattamento RNA sono ancora limitate. Inoltre, il contributo di RNA elaborazione per l'espressione genica differenziale, in particolare per RNA non codificanti, rimane da determinare. Complessivamente, queste limitazioni rappresentano i principali ostacoli permodellazione cinetica bioinformatica dei meccanismi molecolari sottostanti.

Recentemente abbiamo sviluppato un approccio, definito ad alta risoluzione profili di espressione genica, per superare questi problemi 5,7,9. Si basa sulla marcatura metabolica di RNA appena trascritto utilizzando 4 thiouridine (4SU-tagging), un derivato uridina naturale, e offre accesso diretto alle trascrizioni appena trascritto con la minima interferenza nella crescita cellulare e l'espressione genica (vedi Figura 1) 5, 10-12. L'esposizione delle cellule eucariotiche ai risultati 4SU nella sua rapida diffusione, la fosforilazione di 4SU-trifosfato, e l'incorporazione in RNA appena trascritto. Dopo aver isolato RNA cellulare totale, la frazione di RNA 4SU marcato è tiolo specificamente biotinilato generando un legame disolfuro tra biotina e l'RNA appena trascritto. 'RNA cellulare totale' può quindi essere quantitativamente separati in etichetta ('appena trascritto') e senza etichetta ('pre-existing '), l'RNA con elevata purezza utilizzando biglie magnetiche rivestite di streptavidina. Infine, etichettato RNA viene recuperato dalle perline semplicemente aggiungendo un agente riducente (ad esempio ditiotreitolo) scindere il legame disolfuro e libera gli RNA appena trascritto dalle perline.

Recentemente trascritto RNA raffigura l'attività trascrizionale di ogni gene durante il periodo di tempo di esposizione 4SU. 4SU-tagging nella scala temporale di minuti quindi fornisce una fotografia istantanea di espressione genica eucariotica e un modello ideale per a valle bioinformatici analisi (ad esempio l'analisi del promotore). Nei casi in cui le condizioni di steady-state possono essere assunte, i rapporti di recente trascritto / totale, appena trascritte / senza etichetta e senza etichetta / RNA totale forniscono l'accesso non invasivo per RNA precise emivita 7,13. Inoltre, è importante notare che l'RNA appena trascritto purificato dopo appena 5 minuti di 4SU-tagging (5 min 4SU-RNA) è più giovane di 15 e 60 min 4SU-RNA.Quando si esegue entrambi ultra-corta e progressivamente più 4SU-tagging in una singola impostazione sperimentale combinato con RNA-Seq, la cinetica di trasformazione dell'RNA vengono rivelati alla risoluzione nucleotide 9. Infine, l'analisi tempo-corso di RNA appena trascritto e totale in combinazione con modelli computazionali consentono un'analisi integrativa di sintesi di RNA e di decadimento 14.

In conclusione, questo approccio permette l'analisi diretta della dinamica di sintesi dell'RNA, trasformazione e degradazione nelle cellule eucariotiche. È applicabile in tutti i principali organismi modello tra cui mammiferi, insetti (Drosophila), anfibi (Xenopus), e lievito 5,15,16. Esso è direttamente compatibile con microarray analisi 5,17, RNA-Seq 9,13,14, ed è applicabile in vivo 12,15. Qui, abbiamo dettaglio la metodologia di etichettare, isolare e purificare l'RNA appena trascritto in cellule di mammifero in coltura. Inoltre, potenziometrosono discussi Al problemi e le insidie.

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Protocollo

1. Marcatura metabolica con 4 thiouridine

Fare un piano dettagliato del setup sperimentale / programma, ad esempio, quando aggiungere il 4SU di coltura cellulare e quando raccogliere i campioni. Piano per almeno 5 minuti tra ogni condizione. Solo il trattamento di cellule di una condizione alla volta. Maneggiare max. 3-5 piatti in un dato momento. Maneggiare le cellule più rapidamente possibile per ridurre al minimo i cambiamenti di temperatura e livelli di CO 2. Evitare di esporre le cellule alla luce dopo 4SU viene aggiunto in quanto ciò potrebbe causare la reticolazione di RNA 4SU-etichettati per le proteine ​​cellulari.

Avvio di etichettatura

  1. Scongelare a 4 thiouridine (4SU) subito prima dell'uso e pipetta quantità necessaria di 4SU per ogni condizione in un tubo Falcon sterile.
  2. Prendete la quantità di mezzo di coltura cellulare (5 ml per 10 cm di piatto) fuori i piatti e aggiungere al 4SU contenenti tubo Falcon e mescolare accuratamente. Rimuovere e gettare la media residua dai piatti.
  3. Applicare 4SU contenente schienale medio per i piatti.

Fine di etichettatura

  1. Rimuovere coltura cellulare da cellule. Aggiungere 5 ml di Trizol per ogni piatto. Per gli esperimenti complessi, tra cui più punti o condizioni di tempo, questo passo è fatto meglio da due persone, una rimozione del mezzo, l'altra aggiungendo Trizol e raccogliendo il lisato.
  2. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente per lisi cellulare completa.
  3. Utilizzare una pipetta da 10 ml per lavare il piatto con cura con il Trizol aggiunto. Questo favorisce la lisi cellulare completo e il recupero del campione. Maneggiare con cura, come Trizol è estremamente pericoloso al contatto con la pelle o con gli occhi! Avere antidoto per le ustioni fenolo a portata di mano (per esempio polietilenglicole 300 o 400 in alcool denaturato industriale (70:30)). Campioni di trasferimento a tubi di polipropilene. Si prega di notare che i tubi Falcon standard non resistere a queste forze elevate g). I campioni possono essere conservati a -20 ° C per almeno un mese fino RNA totale is preparato.

2. RNA Preparazione Utilizzo Modificata Trizol protocollo

  1. Aggiungere 1 ml di cloroformio (0.2 ml per ml Trizol) e agitare vigorosamente per 15 sec. Incubare a temperatura ambiente per 2 - 3 min.
  2. Centrifugare a 13.000 xg per 15 min a 4 ° C.
  3. Trasferire fase superiore acquosa (contenente l'RNA) in una nuova provetta di polipropilene 15 ml.
  4. Aggiungere ½ il volume di reazione di precipitazione sia RNA tampone e isopropanolo (3 ml per es surnatante aggiungere 1,5 ml di tampone RNA precipitazione e 1,5 ml di isopropanolo).
  5. Mescolare bene. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
  6. Centrifugare a 13.000 xg per 10 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
  7. Centrifugare brevemente (5.000 × g per 30 sec) e rimuovere residui di isopropanolo con pipetta 200 microlitri.
  8. Aggiungere un uguale volume di etanolo 75% e agitare fino a quando il tubo stacca pellet. Evitare di romperlo in tanti piccoli pezzi come questo può rendere la rimozione di residuil difficile etanolo.
  9. Centrifugare a 13.000 xg per 10 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
  10. Spin down RNA brevemente ed eliminare l'etanolo residuo con una pipetta 200 microlitri. Ripetere il passaggio ed eliminare l'etanolo residuo con una pipetta 20 ml. Dopo questi due passaggi, senza ulteriori asciugatura del pellet dovrebbero essere eseguite.
  11. Aggiungere 100 ml di H 2 O a 100 pg di RNA rendimento atteso e mescolare bene pipettando su e giù 5 - 6 volte per aiutare nella dissoluzione del RNA.
  12. Sciogliere e denaturare RNA mediante riscaldamento a 65 ° C per 10 min (agitatore) ed immediatamente posto sul ghiaccio.
  13. Misurare la concentrazione di RNA a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop, seguendo le istruzioni del produttore. Questo RNA può essere conservato a -80 ° C per almeno un mese.

3. Tiolo-specifica Biotinilazione di recente RNA trascritto

  1. Inizia con 60 - 80 mg di RNA cellulare totale.
  2. Costituiscono etichettatura reazione. Pipettare nella seguenteordine (per RNA mcg):
    1. 1 ml 10x Buffer Biotinilazione
    2. 7 RNA microlitri (contenente 1 RNA mcg diluito in nucleasi H 2 O)
    3. 2 microlitri biotina-HPDP (1 mg / ml di DMF)

Aggiungere sempre la biotina-HPDP scorso e mescolare immediatamente da pipettaggio. Nel caso la biotina precipita, contenuti DMF può essere aumentata a una concentrazione finale del 40%.

  1. Incubare a temperatura ambiente per 1,5 ore con rotazione.
  2. Aggiungere un uguale volume di cloroformio. Mescolare energicamente. Incubare per 2-3 minuti fino a quando le fasi cominciano a separarsi e bolle iniziano a scomparire.
  3. Centrifugare a 20.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Trasferire accuratamente la fase superiore acquosa in una nuova provetta.
  4. Ripetere i passi 3.4 e 3.5 una volta. Si consiglia di eseguire questo passaggio in 2 ml di blocco Gel tubi pesanti fase per ridurre la perdita di RNA.
  5. RNA precipitazione: add 1/10 del volume di 5 M NaCl e un volume uguale diisopropanolo alla fase acquosa.
  6. Centrifugare a 20.000 xg per 20 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
  7. Aggiungere un uguale volume di etanolo 75%, centrifugare a 20.000 xg per 10 min a 4 ° C, scartare il surnatante.
  8. Spin brevemente ed eliminare l'etanolo residuo con 200 microlitri pipetta.
  9. Spin brevemente ed eliminare l'etanolo residuo con 20 microlitri pipetta.
  10. Non permettere che l'RNA si asciughino. Risospendere in 50 - 100 ml H 2 O (~ 1 ml per 1 mg di input RNA). Mescolare bene pipettando su e giù per 5-6 volte.
  11. Verificare la qualità dell'RNA mediante analisi electrophoretical per escludere la degradazione dell'RNA.

4. Dot Blot Analisi di 4SU-incorporazione (Opzionale)

Incorporazione 4SU può essere facilmente determinata da analisi dot blot di RNA biotinilato. Questo è un passaggio facoltativo che consente la risoluzione dei problemi e la stima dei tassi di incorporazione 4SU relativi a un controllo biotinilato oligo DNA. Per questo test abbiamo recommend utilizzando iodoacetyl-biotina invece di biotina-HPDP per biotinilazione di RNA 4SU-etichettati in fase 3.2. Ciò si traduce in un biotinilazione irreversibile di 4SU-RNA. Pertanto, (ad es RNeasy) possono essere utilizzati metodi basati colonna per il recupero di molto più piccole quantità di RNA biotinilato (ad esempio 5 mg). Mentre RNA biotinilato utilizzando biotina-HPDP è adatto anche per questo saggio, il segnale risultante è più debole e il rapporto segnale-rumore meno favorevole (Figura 3).

  1. Seguire il protocollo per 4SU-etichettatura e l'isolamento di RNA cellulare totale, come descritto nelle sezioni 1 e 2.
  2. Biotinylate 4SU marcato RNA come descritto nel capitolo 3 sostituendo biotina-HPDP con iodoacetyl-biotina ed effettuare due estrazioni cloroformio per rimuovere completamente i residui di iodoacetyl-biotina eccessivi.
  3. Recuperare RNA biotinilati da isopropanolo / etanolo precipitazione come descritto o con un approccio basato su colonne (es RNeasy) nel caso di piccole quantità di RNA (<10 mcg) Sono utilizzati.
  4. Incubare la membrana Zeta in acqua priva di nucleasi con dondolo per 10 min.
  5. Prendere la membrana fuori dall'acqua nucleasi e rimuovere i liquidi eccessivi mettendo membrana tra due tovaglioli di carta puliti e premendo con decisione. Aria di essiccazione la membrana per 5 minuti si tradurrà in punti più belli.
  6. Per ogni campione, preparare 20 ml di RNA 200 ng / ml usando ghiaccio freddo dot blot tampone di legame (10 mM NaOH, 1 mM EDTA). Applicare 5 ml di questa diluizione (cioè 1 mg di RNA) e tre successive diluizioni di 10 volte (cioè 100, 10, e 1 ng di RNA, rispettivamente) alla membrana Zeta pipettando. Pipettaggio attraverso un rack vuoto di puntali possono essere impiegati per fornire spaziatura uniformemente distribuito. In alternativa, utilizzare un apparato di dot blot secondo le istruzioni del produttore.
  7. Applicare 5 pl della biotina marcato DNA oligo a concentrazioni comprese tra 20 ng / ml a 20 pg / ml (ossia 100-0,1 ng oligo) come cont positivorol alla membrana mediante pipettaggio. Utilizzare un biotinilato, campione 4SU naive come controllo negativo.
  8. Far asciugare la membrana per 5 min.
  9. Incubare la membrana per 30 minuti in 40 ml di tampone di bloccaggio con dondolo.
  10. Incubare la membrana con 10 ml di 1:1.000 streptavidina-perossidasi di rafano per 15 min (5 ml di PBS + 5 ml di 20% SDS + 10 pl streptavidina-perossidasi di rafano)
  11. Lavare membrana due volte in 40 ml di PBS + 10% SDS (20 ml di PBS + 20 ml di 20% SDS) per 5 min.
  12. Lavare membrana due volte in 40 ml di PBS + 1% SDS (38 ml PBS + 2 ml di 20% SDS) per 5 min.
  13. Lavare membrana due volte in 40 ml di PBS + 0,1% SDS (40 ml PBS + 200 microlitri 20% SDS) per 5 min.
  14. Rimuovere il liquido eccessivo mettendo membrana tra due tovaglioli di carta puliti e premendo su di loro con fermezza.
  15. Visualizza legata alla membrana HRP utilizzando ECL le istruzioni del produttore.
  16. Trasferire la membrana in pellicola plastica / sacchetto, rimuovere le bolle d'aria e incubare per 2 minuti al buio.
  17. Esporre membranapellicola per 1-5 min.

5. Separazione di RNA etichettati e senza etichetta Uso rivestite di streptavidina biglie magnetiche

  1. Calore tampone di lavaggio (3 ml per campione) a 65 ° C in un bagno d'acqua.
  2. Preparare fresco 100 mM ditiotreitolo (DTT) in nucleasi H 2 O. Fatelo per decantazione 15-30 mg di polvere DTT in un ambiente pulito tubo da 50 ml Falcon collocato sulla scala ultra-fine. Pesare e aggiungere la quantità necessaria di nucleasi H 2 O.
  3. Calore biotinilato campioni di RNA a 65 ° C per 10 minuti per denaturare ed immediatamente posto sul ghiaccio.
  4. Luogo μMacs colonne nel supporto magnetico. Si raccomanda di non elaborare più di 12 campioni per volta (6-8 campioni sono ottimali).
  5. Pre-equilibrare colonne MILTENYI con 1 ml di tampone di lavaggio temperatura ambiente. Questo richiederà circa 15 min.
  6. Nel frattempo, aggiungere 100 ml di perline streptavidina a 50 - 100 ml di RNA biotinilato. Incubare a temperatura ambiente per 15 min con rotazione.
    7. < li> Se una qualsiasi delle colonne non ha avviato drenante ormai questo può essere facilitato da una leggera pressione sulla parte superiore della colonna con un dito guantato. Una volta che il flusso è avviato colonne drenano facilmente.
  7. Applicare le RNA / branelli per le colonne. Gettare il flow-through a meno che non si desidera recuperare la frazione di RNA non marcato (vedi sezione 7).
  8. Lavare tre volte con 0,9 ml di 65 ° C tampone di lavaggio (1 ml puntali si restringono quando pipettaggio buffer a 65 ° C).
  9. Lavare tre volte con 0,9 ml di tampone di lavaggio temperatura ambiente.
  10. Pipetta 700 microlitri Buffer RLT (RNeasy MinElute Cleanup Kit, Qiagen) in nuovi ml provette 2 e metterli sotto le colonne.
  11. Eluire l'RNA appena trascritto nel buffer RLT con l'aggiunta di 100 ml di 100 mM DTT alle colonne.
  12. Eseguire una eluizione secondo turno 3 minuti più tardi nella stessa provetta con l'aggiunta di altri 100 ml di 100 mM DTT.

6. Recupero di recente RNA trascritto

ontent "> Continua con la Pulitura MinElute RNeasy (Qiagen) protocollo seguendo le istruzioni del produttore. Elute in 25 H 2 O. concentrazioni di RNA Misura nucleasi microlitri utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop. Per evitare la necessità di scongelare e ricongelare RNA prima di presentare ad un saggio ad alta prestazione, si consiglia di preparare cDNA subito dopo la nuova trascritto RNA è purificato. Utilizzare 2,5 ml di RNA appena trascritto in 20 microlitri mix sintesi del DNA per la sintesi del DNA seguendo le istruzioni del produttore. Eseguire controlli di RT-PCR quantitativa utilizzando 1 : 10 diluizioni del mix cDNA Conservare RNA a -80 ° C..

7. Recupero di Senza etichetta, Unbound RNA (Opzionale)

Nel caso l'RNA non associato devono essere recuperati; raccogliere e combinare il flusso passante (dopo l'aggiunta della soluzione perline RNA-streptavidina alle colonne) ed il primo lavaggio per successiva precipitazione. Di solito è sufficiente per far precipitare solo il 50% del non legato RNA come this conterrà> 80% del materiale di partenza.

  1. Aggiungere un uguale volume di isopropanolo (senza sale deve essere aggiunto come tampone di lavaggio contiene già 1 M NaCl).
  2. Centrifugare a 20.000 xg per 20 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
  3. Aggiungere un uguale volume di etanolo 75%, centrifugare a 20.000 xg per 10 min a 4 ° C, scartare il surnatante.
  4. Spin brevemente ed eliminare l'etanolo residuo con 200 microlitri pipetta.
  5. Spin brevemente ed eliminare l'etanolo residuo con 20 microlitri pipetta.
  6. Non permettere che l'RNA si asciughino. Risospendere in 100 ml H 2 O. Mescolare bene pipettando su e giù per 5-6 volte. Incubare a 65 ° C per 10 minuti con agitazione e trasferire direttamente su ghiaccio.
  7. Verificare la qualità dell'RNA mediante analisi electrophoretical per escludere la degradazione dell'RNA.

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Risultati

1. Materiale di partenza e di rendimenti attesi

A seguito di 1 ora (ora) di 4SU-esposizione appena trascritto RNA rappresenta circa il 1-4% del totale RNA cellulare. Questa sarà la più bassa in cellule di crescita-arrestati in quanto sintetizzano più RNA per conto per la crescita cellulare / replica. Quando l'etichettatura per 1 ora, si consiglia di iniziare il test con 60 - 80 mg di RNA totale. Partendo con meno di 30 microgrammi di RNA totale risultati in piccoli pellet di RNA che sono di...

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Discussione

Marcatura metabolica di nuova trascritto RNA aumenta sensibilmente la potenza delle tecnologie high-throughput, come microarrays e RNA-Seq fornendo modelli più adeguati per affrontare la questione biologica di interesse. Il presente protocollo ha subito ottimizzazione vasta. Permette> 1.000 volte arricchimento di RNA appena trascritto e fornisce risultati altamente riproducibili.

Il disegno sperimentale di un esperimento 4SU-tagging è di importanza cruciale come RNA trascritto appena si r...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare Amie Regan per un'attenta lettura del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da NGFN Inoltre concessione # 01GS0801, MRC comunione concessione G1002523 e NHSBT concessione WP11-05 al LD ​​e DFG concessione FR2938/1-1 alla CCF

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
4-tiouridinaCarbosynthT4509Preparare 50 mM di stock in H2O, conservare a -20 ° C in aliquote da 50-500 μ l, gettare il reagente non utilizzato, non ricongelare.
TrizolInvitrogen15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)AVVERTENZA - CORROSIVO e PERICOLOSO PER LA SALUTE! Garantire l'accesso immediato all'antidoto fenolico (PEG-Metanolo); Conservare a 4 °C.
CloroformioSigma372978AVVERTENZA - PERICOLOSO PER LA SALUTE
IsopropanoloSigma650447
Citrato di sodio, senza nucleasiSigmaC8532Preparare una soluzione madre 1,6 M utilizzando acqua priva di nucleasi.
5M NaCl Sigma71386Soluzione madre
H2O senza nucleasiSigmaW4502Produrre aliquote da 1 ml in provette prive di nucleasi.
di precipitazione dell'RNA1,2 M NaCl, 0,8 M citrato di sodio in acqua priva di nucleasi. Preparare in anticipo in condizioni rigorosamente prive di nucleasi. Conservare a temperatura ambiente in provette falcon da 50 ml.
EtanoloSigma459844Utilizzare con acqua priva di nucleasi per preparare etanolo all'80%, conservare a -20 °C.
1 M Tris Cl privo di nucleasi, pH 7,5Lonza51237Soluzione madre
500 mM EDTA senza nucleasi, pH 8,0Invitrogen15575-020Soluzione madre
10x Tampone di biotinilazione (BB)100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA in acqua priva di nucleasi, fare aliquote da 1 ml.
Dimetilformammide (DMF)SigmaD4551
EZ-Link biotina-HPDPPierce21341Preparare 1 mg/ml di soluzione madre sciogliendo 50 mg di biotina-HPDP in 50 ml di DMF. Il riscaldamento delicato migliora la solubilizzazione. Conservare a 4 gradi C in aliquote da 1 ml.
Phase Lock Gel Heavy tubes 2,0 mlEppendorf0032 005.152Opzionale per la fase di estrazione del cloroformio.
Membrana ZetaBIORAD162-0153
10x Tampone100 mM NaOH, 10 mM EDTA
Biotina-oligo5'-biotina, 25 nucleotidi, qualsiasi sequenza
Sodio dodecil solfatoFisherBPE9738Per 100 ml di soluzione madre al 20%, aggiungere 20 g di SDS a 80 ml di PBS pH 7-8 e regolare il volume a 100 ml. Mantenere tutte le soluzioni SDS ad alta percentuale al di sopra di 20 °C. Caldo le soluzioni leggermente dovrebbero precipitare SDS.
EZ-Link Iodoacetyl-LC-BiotinPierce21333Preparare 1 mg/ml di soluzione madre sciogliendo 50 mg di iodoacetil-biotina in 50 ml di DMF. Il riscaldamento delicato migliora la solubilizzazione. Conservare a 4 gradi C in aliquote da 1 ml. Genera una biotinilazione irreversibile e specifica per i tioli.
Soluzione salina tampone fosfatoGibco10010-015
Tampone bloccanteMiscelare 20 ml 20% SDS con 20 ml 1 x PBS pH 7-8 e aggiungere EDTA alla concentrazione finale di 1 mM.
Streptavidina-rafano perossidasi Vector LaboratoriesSA5004Conservare a -20 °C. Mescolare 10 ml 20% SDS con 10 ml 1 x PBS. Aggiungi 20 μ l. Streptavidina-HRP prima dell'uso.
Reagente ECLGE HealthcareRNP2109Utilizzare seguendo le istruzioni del produttore.
Pellicola Super RX, X-RA, 18x24 cmFujifilm47410 19236
μ Macs Streptavidin KitMiltenyi130-074-101Conservare le perline a 4 °C.
Tween 20SigmaP1379
Tampone100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,1% Tween 20 in H2O privo di nucleasi.
Ditiotreitolo (DTT)Sigma43817Preparare come 100 mM di DTT in H2O senza nucleasi, preparare sempre fresco prima dell'uso.
RNeasy MinElute KitQiagen74204Memorizza colonne a 4 gradi C, componenti rimanenti del kit a temperatura ambiente.
Provette in polipropilene con tappo a vite da 1,5 mlSarstedt72.692.005Compatibile con Dimetilformammide
Tubi in polipropilene con tappo a vite da 2,0 mlSarstedt72.694.005Compatibile con Dimetilformammide
Provette da 15 mlBD Falcon352096Compatibile con Dimetilformammide
Provette da 50 mlBD Falcon352070Compatibile con Dimetilformammide
Tutte le soluzioni/reagenti devono essere conservati a temperatura ambiente se non diversamente specificato.
Equipment
Spettrofotometro UV/VISThermo ScientificNanoDrop 1000O equivalente. Utilizzare un volume basso (1-2 μ l) per misure di basse concentrazioni di RNA per evitare un'eccessiva perdita di campione.
Provette da centrifuga in polipropilene da 15 mlVWR International525-0153A differenza delle provette standard da 15 ml, tollerano fino a 15.000 × g
Centrifuga ad alta velocitàBeckman CoulterAvanti J-25O apparecchiature equivalenti in grado di raggiungere i 13.000× g
Rotore ad alta velocitàBeckman CoulterJLA-16250O attrezzatura equivalente in grado di raggiungere 13.000× g
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Riferimenti

  1. Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
  2. Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  3. Nagalakshmi, U., Wang, Z., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
  4. Wilhelm, B. T., Marguerat, S., et al. Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution. Nature. 453, 1239-U1239 (2008).
  5. Dölken, L., Ruzsics, Z., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
  6. Yang, E., van Nimwegen, E., et al. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13, 1863-1872 (2003).
  7. Friedel, C. C., Dölken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37, e115(2009).
  8. Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463, 457-463 (2010).
  9. Windhager, L., Bonfert, T., et al. Ultra short and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. , (2012).
  10. Melvin, W. T., Milne, H. B., Slater, A. A., Allen, H. J., Keir, H. M. Incorporation of 6-thioguanosine and 4-thiouridine into RNA. Application to isolation of newly synthesised RNA by affinity chromatography. Eur. J Biochem. 92, 373-379 (1978).
  11. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23, 232-237 (2005).
  12. Kenzelmann, M., Maertens, S., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 6164-6169 (2007).
  13. Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  14. Rabani, M., Levin, J. Z., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat. Biotechnol. , (2011).
  15. Miller, M. R., Robinson, K. J., Cleary, M. D., Doe, C. Q. TU-tagging: cell type-specific RNA isolation from intact complex tissues. Nat. Methods. 6, 439-441 (2009).
  16. Miller, C., Schwalb, B., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol. Syst. Biol. 7, 458(2011).
  17. Weintz, G., Olsen, J. V., et al. The phosphoproteome of toll-like receptor-activated macrophages. Mol. Syst. Biol. 6, 371(2010).
  18. Lipsett, M. N. The isolation of 4-thiouridylic acid from the soluble ribonucleic acid of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 240, 3975-3978 (1965).
  19. Marcinowski, L., Liedschreiber, M., et al. Real-time Transcriptional Profiling of Cellular and Viral Gene Expression during Lytic Cytomegalovirus Infection. PLoS Pathog. 8, e1002908(2012).
  20. Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19, 942-945 (1995).
  21. Friedel, C. C., Dölken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol. Biosyst. 5, 1271-1278 (2009).
  22. Friedel, C. C., Kaufmann, S., Dölken, L., Zimmer, R. HALO - A Java framework for precise transcript half-life determination. Bioinformatics. , (2010).

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