In questo articolo si descrive la preparazione di tessuti melanoma appena ottenuto in colture cellulari primarie, e come rimuovere le contaminazioni di eritrociti e fibroblasti dalle cellule tumorali. Infine, si descrive come CD133 + Putative cellule staminali di melanoma sono ordinati dal CD133 - Massa utilizzando activated cell sorting magnetico (MACS).
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Articolo metodologico
Paziente coltura cellulare derivato e isolamento di CD133
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nonostante il miglioramento delle opzioni di trattamento per il melanoma oggi disponibili, pazienti con melanoma maligno ancora hanno una prognosi sfavorevole per la sopravvivenza libera da progressione e globale. Pertanto, la ricerca traslazionale ha bisogno di fornire altre prove per migliorare le terapie molecolari mirate per i melanomi maligni. In passato, i meccanismi oncogenici correlate a melanoma sono stati ampiamente studiati in linee cellulari stabilizzate. Sulla strada per regimi di trattamento più personalizzati basati su profili genetici individuali, si propone di utilizzare paziente linee cellulari derivate invece di linee cellulari generici. Insieme con i dati clinici di elevata qualità, in particolare sul follow-up, queste cellule sarà determinante per comprendere meglio i meccanismi molecolari alla base della progressione del melanoma.
Qui, si segnala l'istituzione di colture primarie di melanoma sezionato tessuto tumorale fresco. Questa procedura include macinazione e la dissociazione del tessuto in cellule singole, rerimozione di contaminazioni con eritrociti e fibroblasti così come la cultura primaria e affidabile verifica di origine melanoma delle cellule.
Recenti studi hanno rivelato che i melanomi, come la maggior parte dei tumori, porto una piccola sottopopolazione di cellule staminali tumorali (CSC), che sembrano alimentare esclusivamente l'iniziazione del tumore e la progressione verso lo stato metastatico. Uno degli indicatori chiave per l'identificazione e l'isolamento CSC nel melanoma è CD133. Per isolare CD133 + CSC da colture primarie di melanoma, abbiamo modificato e ottimizzato la magnetico selezione delle cellule attivate (MACS) procedura dal Miltenyi con conseguente elevata purezza smistamento e la vitalità delle CD133 + e CD133 CSC - massa, che può essere coltivato e funzionalmente analizzati successivamente.
Introduzione
Cutanee melanomi maligni sono il tipo meno comune, ma più mortale di cancro della pelle. A causa di un aumento dei casi, un alto grado di malignità e di una rapida diffusione, melanomi ora rappresentano il 75% dei tumori maligni della pelle correlate 1,2 morti. Oltre l'asportazione chirurgica del tumore primitivo, chemioterapia, radioterapia, immunoterapia e combinati chemio-immunoterapia del melanoma e metastasi sono state-of-the-art di strategie per il trattamento del melanoma 3,4. Tuttavia, il melanoma maligno è caratterizzato da una scarsa risposta a chemioterapici (5-12%), 5,6, e solo quelli il 50-70% dei pazienti affetti da ....
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Protocollo
La struttura generale della dell'esperimento compresa la preparazione di singole cellule primarie da tessuto tumorale, la caratterizzazione della coltura di cellule primarie, deplezione fibroblasti e cell sorting magnetico di CD133 + e CD133 - cellule di melanoma è mostrato in Figura 1.
1. Esempio di acquisizione
- Verificare la presenza di approvazione etica prima di considerare i passi successivi.
- Preparare un tubo da 50 ml con PBS sterile supplementato con 1% di penicillina-streptomicina concentrazione finale e la consegna di un intervento chirurgico o di squadra.
- ....
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Risultati
Preparazione di singole cellule di tessuto tumorale
La figura 2 esemplifica una metastasi linfa resecata nodo di un paziente prima fase tardiva melanoma (A) e dopo (B) meccanica dissociazione in 2-4 pezzi millimetri. Seguendo dissociazione enzimatica del tessuto e filtrazione attraverso una maglia di nylon 70 pm, cellule sono state pellettizzate e il supernatante scartato. In questa fase abbiamo osservato un'elevata contaminazione con eritrociti come indicato dal colore ros.......
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Discussione
Al fine di rimuovere contaminazioni eritrocitari dal pellet cellulare tumorale si consiglia di utilizzare la soluzione di globuli rossi del sangue lisi da Miltenyi. I vantaggi di lisare gli eritrociti rispetto alla tradizionale centrifugazione in gradiente di densità Ficoll sono che è più veloce e più semplice. Inoltre, contaminazioni con Ficoll o globuli rossi e la perdita di cellule tumorali sono evitati. Quando si osserva la crescita dei fibroblasti in coltura cellulare primaria devono essere rimossi immediatamente, .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Prof. M. Dietel e Dirk Schumacher per sostenere questo lavoro e criticamente la lettura del manoscritto.
La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto il sostegno del innovativi in materia di medicinali impresa comune ai sensi della convenzione di sovvenzione n ° 115234, le risorse di cui sono composte di partecipazione finanziaria del Settimo programma quadro dell'Unione europea (FP7/2007-2013) e le imprese 'in dell'EFPIA contributo di natura. Questo lavoro è stato supportato anche dal Krebsgesellschaft Berliner (BKG).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagente | |||
| Accutase | PAA Laboratories GmbH | L11-007 | |
| Amfotericina B soluzione 250 mg / ml in acqua deionizzata | Sigma-Aldrich, Inc. | A2942-50ml | |
| anti-fibroblasti microsfere | Miltenyi Biotec GmbH | 130-050-601 | |
| CD133 / 1 (W6B3C1) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-395 | |
| Collagenasi IV | Sigma-Aldrich, Inc. | C5138 | |
| DNasi I | , Ltd | A3778.0050 | |
| D-PBS senza Ca, Mg | PAA Laboratories GmbH | H15-002 | |
| Etilendiammintetraacetato sale disodico diidrato (EDTA) | Sigma-Aldrich, Inc. | E-7889 | |
| FBS Superior | Biochrom | S0615 | |
| Indiretta CD133 Micro-Bead Kit umano | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-895 | Include: CD133 / 1 (AC133)-biotina, anti-biotina microsfere e il reagente FcR blocco |
| Penicillina-Streptomicina, liquido (100x) | Invitrogen GmbH | 15140-122 | |
| Quantum 263 | PAA Laboratories GmbH | U15-815 | |
| Blood Red Cell Lysis Solution (10x) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-094-183 | |
| Attrezzatura | |||
| Cell filtro (70 micron) | BD Biosciences | 352350 | |
| gentleMACS C Tubi | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-237 | |
| gentleMACS dissociatore | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-235 | |
| MACS Separator Supporto Multi | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
| Colonne di separazione MACS 25 colonne LS | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-401 | |
| MACSmix Tubo Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-753 | |
| Natriumchloride | Merck KGaA | 567440-1KG | |
| Pre-Filtri di separazione | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | |
| QuadroMACS separatore | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-976 | |
| Rotilabo-siringa filtri (0.22 micron, PSE) | Carl Roth GmbH & Co. KG | P668.1 | |
| Steritop-GP filtro 500 ml | Miltenyi Biotec GmbH | SCGPS05RE |
Riferimenti
- Garibyan, L., Fisher, D. E. How sunlight causes melanoma. Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).
- Radovic-Kovacevic, V., et al. Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma. Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).
- Lens, M. B., Eisen, T. G.
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Ristampe e permessi
