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Articolo metodologico

Paziente coltura cellulare derivato e isolamento di CD133

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DOI:

10.3791/50200

⸱

13 marzo 2013

 ,  ,  , 
1Institute of Pathology, Laboratory of Molecular Tumor Pathology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 2Institute for Chemistry and Biochemistry, Free University Berlin, 3Laboratory for Functional Genomics Charité (LFGC), Charité - Universitätsmedizin Berlin, 4Comprehensive Cancer Center Charité, Charité - Universitätsmedizin Berlin

In questo articolo

Sommario

In questo articolo si descrive la preparazione di tessuti melanoma appena ottenuto in colture cellulari primarie, e come rimuovere le contaminazioni di eritrociti e fibroblasti dalle cellule tumorali. Infine, si descrive come CD133 + Putative cellule staminali di melanoma sono ordinati dal CD133 - Massa utilizzando activated cell sorting magnetico (MACS).

Abstract

Nonostante il miglioramento delle opzioni di trattamento per il melanoma oggi disponibili, pazienti con melanoma maligno ancora hanno una prognosi sfavorevole per la sopravvivenza libera da progressione e globale. Pertanto, la ricerca traslazionale ha bisogno di fornire altre prove per migliorare le terapie molecolari mirate per i melanomi maligni. In passato, i meccanismi oncogenici correlate a melanoma sono stati ampiamente studiati in linee cellulari stabilizzate. Sulla strada per regimi di trattamento più personalizzati basati su profili genetici individuali, si propone di utilizzare paziente linee cellulari derivate invece di linee cellulari generici. Insieme con i dati clinici di elevata qualità, in particolare sul follow-up, queste cellule sarà determinante per comprendere meglio i meccanismi molecolari alla base della progressione del melanoma.

Qui, si segnala l'istituzione di colture primarie di melanoma sezionato tessuto tumorale fresco. Questa procedura include macinazione e la dissociazione del tessuto in cellule singole, rerimozione di contaminazioni con eritrociti e fibroblasti così come la cultura primaria e affidabile verifica di origine melanoma delle cellule.

Recenti studi hanno rivelato che i melanomi, come la maggior parte dei tumori, porto una piccola sottopopolazione di cellule staminali tumorali (CSC), che sembrano alimentare esclusivamente l'iniziazione del tumore e la progressione verso lo stato metastatico. Uno degli indicatori chiave per l'identificazione e l'isolamento CSC nel melanoma è CD133. Per isolare CD133 + CSC da colture primarie di melanoma, abbiamo modificato e ottimizzato la magnetico selezione delle cellule attivate (MACS) procedura dal Miltenyi con conseguente elevata purezza smistamento e la vitalità delle CD133 + e CD133 CSC - massa, che può essere coltivato e funzionalmente analizzati successivamente.

Introduzione

Cutanee melanomi maligni sono il tipo meno comune, ma più mortale di cancro della pelle. A causa di un aumento dei casi, un alto grado di malignità e di una rapida diffusione, melanomi ora rappresentano il 75% dei tumori maligni della pelle correlate 1,2 morti. Oltre l'asportazione chirurgica del tumore primitivo, chemioterapia, radioterapia, immunoterapia e combinati chemio-immunoterapia del melanoma e metastasi sono state-of-the-art di strategie per il trattamento del melanoma 3,4. Tuttavia, il melanoma maligno è caratterizzato da una scarsa risposta a chemioterapici (5-12%), 5,6, e solo quelli il 50-70% dei pazienti affetti da melanoma che trasportano il gene BRAF V600E beneficio mutazione da promettenti nuove terapie mirate, come il trattamento con vemurafenib 7 Per migliorare la sopravvivenza complessiva, una migliore comprensione dei meccanismi di tumorigenesi melanoma è necessario.

Per studiare questi meccanismi in passato, consolidata commerlinee cellulari cialmente disponibili sono stati utilizzati. Approcci più recenti per studiare gli eventi molecolari di iniziazione e la progressione del cancro utilizzare colture primarie derivate direttamente dal tessuto tumorale - un cuscinetto molteplici vantaggi strategici: Il ricercatore ha il pieno controllo del paziente e selezione dei tessuti. Le cellule campionate acquisita sapientemente selezionato tessuto tumorale, assomigliano il tumore con tutta la sua eterogeneità e follow-up dei dati del paziente e un dettagliato patologia è disponibile per consentire le caratteristiche della cultura per essere confrontati con quelli del tumore originale 8.

Al contrario, l'utilizzo di linee cellulari stabilizzate come sistemi modello nella ricerca sul cancro è discusso polemicamente. Già nel 1987 Osborne e colleghi hanno descritto significative differenze biologiche tra MCF-7 linee di cellule di cancro al seno umano da diversi laboratori 9. Questa instabilità genomica ampia variazione e l'espressione di RNA durante sottocultura era confirmed da Hiorns et al. e ha fornito i dati di supporto per le prove del fatto che le linee di cellule si evolvono nella cultura, indebolendo in tal modo la rilevanza diretta delle culture così stabiliti come modelli di cancro umano 10.

Un'altra considerazione importante, che è stata largamente ignorata nel corso degli anni, è il rischio di contaminazione o di crescita eccessiva di culture con estranei "falsi" delle cellule, che è stato evidenziato più di venti anni fa, dimostrando che un gran numero di linee cellulari sono stati contaminati da HeLa cellule 8,11. L'errata interpretazione dei dati di "falsi" linee cellulari è recentemente venuto alla luce nella letteratura di nuovo. Utilizzando una combinazione di DNA profiling e citogenetica molecolare, MacLeod et al. Rivelato che su 252 nuovi tumori derivati ​​da linee cellulari umane depositato presso la Collezione tedesca di microrganismi e colture cellulari (DSMZ), circa il 18% sono risultati intraspecie o interspecie croce -contaminanti 12,13.

Per evitare questi problemi e di sfruttare i vantaggi di cui sopra, abbiamo deciso di stabilire basso passaggio da linee cellulari di melanoma metastasi asportati recentemente.

Robuste cellule tecnologie di separazione e di analisi richiedono monocellulari preparati da generare contemporaneamente limitando la morte cellulare e la distruzione delle proteine ​​di superficie caratteristici. Uno strumento da banco per la dissociazione automatico di tessuti in sospensioni monocellulari è il dissociatore gentleMACS prodotto da Miltenyi. Quando usato in combinazione con gentleMACS C Tubi e ottimizzato soluzioni dissociazione, una dissociazione efficace e delicata del tessuto tumorale in un sistema chiuso viene raggiunto mantenendo epitopi antigenici e riducendo la perdita delle cellule. Lo strumento dispone ottimizzati, programmi preimpostati per una varietà di applicazioni specifiche e garanzie preparazione standardizzata di sospensioni monocellulari di melanoma tessuto 14.

Studi recenti hanno rivelato che la maggior parte dei tumori porto una piccola sottopopolazione di cellule tumorali cosiddette staminali (CSC), che presentano esclusivamente tumore inizia e si auto-rinnovano capacità. L'identificazione di melanociti che producono cellule staminali nel derma della pelle ha portato a formulare l'ipotesi che queste cellule potrebbero essere l'origine delle cellule staminali tumorali (CSC) nel melanoma, perché l'esposizione alle radiazioni UVA possono innescare queste cellule per la trasformazione maligna 15. Il risultato di tale lesione genetica sarebbe cellule che ospitano una combinazione di tumore e le caratteristiche delle cellule staminali.

Uno degli indicatori chiave proposti per rappresentare la sottopopolazione di CSC nel melanoma è CD133 16-20. CD133 (noto anche come Prominin 1), un membro di glicoproteine ​​transmembrana pentaspan, viene espressa in cellule staminali ematopoietiche, cellule progenitrici endoteliali, cellule staminali neuronali e gliali 21-23. Espressione di CD133 è correlata condivisione cellulare asimmetrica 24, e l'epitopo glicosilata del CD133 è dimostrato downregulated sulla differenziazione cellulare 25. Recentemente, CD133 + cellule di melanoma hanno mostrato di avere auto-rinnovamento e tumore iniziazione capacità di 19,20.

Per studiare la funzione di CD133 + putativo melanoma CSC, abbiamo modificato e ottimizzato la magnetico selezione delle cellule attivate (MACS) sistema da Miltenyi Biotech per ottenere popolazioni altamente arricchito e vitale di CD133 + e CD133 - cellule.

Magnetica tallone basata separazione cellulare permette a ciascuna selezione negativa, come mostrato da Matheu et al. 26 o selezione positiva, come indicato,. Durante la selezione positiva il particolare tipo di cellula bersaglio, ad esempio, le cellule che esprimono CD133, è magneticamente etichettato con microsfere, 50-nm particelle superparamagnetiche che sono coniugati ad anticorpi altamente specifici nei confronti di unparticolare cellula antigene di superficie. Durante la separazione, le cellule marcate magneticamente sono trattenute all'interno della colonna nel campo magnetico del separatore, mentre le cellule non marcate fluire attraverso. Seguendo fasi di lavaggio, la colonna viene rimosso dal campo magnetico del separatore, e le cellule bersaglio vengono eluite dalla colonna. Il LS o colonne MS utilizzata durante la selezione risultato positivo in frazioni di cellule marcate e non marcato con elevata purezza. D'altra parte, colonne LD, utilizzati per la selezione negativa, risultato in una purezza leggermente inferiore della frazione etichettato. A causa della densa confezionamento di loro matrice portata in queste colonne è inferiore a un rischio più elevato di celle non etichettati da intrappolati nella colonna. Colonne LD deve pertanto essere utilizzato solo per l'esaurimento rigorosa di una sottopopolazione cellulare indesiderata. Selezione positiva può essere eseguita direttamente (anticorpo accoppiato a microsfere) o indiretto marcatura magnetica (incubazione con microsfere seguito incubation con l'anticorpo primario). MACS specifici microperline sono disponibili per la selezione positiva di numerosi tipi di cellule primarie di cellule tumorali come prostatico o melanoma 27.

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Protocollo

La struttura generale della dell'esperimento compresa la preparazione di singole cellule primarie da tessuto tumorale, la caratterizzazione della coltura di cellule primarie, deplezione fibroblasti e cell sorting magnetico di CD133 + e CD133 - cellule di melanoma è mostrato in Figura 1.

1. Esempio di acquisizione

  1. Verificare la presenza di approvazione etica prima di considerare i passi successivi.
  2. Preparare un tubo da 50 ml con PBS sterile supplementato con 1% di penicillina-streptomicina concentrazione finale e la consegna di un intervento chirurgico o di squadra.
  3. Organizza il trasporto veloce di tessuto tumorale da un intervento chirurgico al laboratorio di coltura cellulare a 4 ° C.

2. Preparazione primarie Melanoma singole cellule da tessuto tumorale

  1. Eseguire tutte le operazioni in condizioni sterili.
  2. Prima resezione del tumore, si ha la necessità di preparare l'impasto dissociazione. 10 ml mix dissociazione a 2-4 g di tessuto è richiesto. La miscela può essere utilizzata immediapletamente o conservati in aliquote da 10 ml a -20 ° C per un uso successivo.
    1. Preparare una soluzione contenente cloruro di sodio 150 mM. Mescolare con un vortice fino a quando la soluzione è limpida. Se necessario, filtrato sterile di cloruro di sodio usando un filtro di 0,22 micron.
    2. Pesare DNasi I e preparare una soluzione contenente 10 mg / ml DNasi I in cloruro di sodio 150 mM. Mescolare capovolgendo finché la soluzione è limpida.
    3. Preparare una soluzione contenente 100mg/ml Collagenase IV in PBS. Mescolare capovolgendo finché la soluzione è limpida. Aliquote di soluzione di collagenasi può essere conservato a -20 ° C per diversi mesi.
    4. Preparare l'impasto dissociazione con una concentrazione finale di 1% Penicillina-Streptomicina, 1 mg / ml di collagenasi IV e 0,1 mg / ml in terreno di DNasi I Quantum 263. Mescolare con un vortice. Opzionale: quando si usa il tessuto derivato dalla soluzione di melanoma cutaneo aggiuntivo Amfotericina B al mix dissociazione ad una concentrazione finale di 1,5 mg / ml di amfotericina B.
  3. Preriscaldare il reqquantità uired di dissociazione mix, PBS e Quantum medie 263-37 ° C.
  4. Luogo tessuto tumorale su una piastra di Petri sterile. Aspirare la soluzione in eccesso dal tessuto e aggiungere 500 microlitri mix dissociazione. Tritare tumore in piccoli pezzi di 2-4 mm con l'utilizzo freschi, bisturi sterili.
  5. Trasferimento 2-4 g macinata tessuto tumorale in un tubo gentleMACS C contenente 5 ml mix dissociazione. Sciacquare piastra Petri con l'aggiunta di 4,5 ml di dissociazione mescolare e aggiungere frammenti di tessuto rimasti alla metropolitana gentleMACS C.
  6. Chiudi gentleMACS tubo C e collegarlo a testa in giù sulla bussola del dissociatore gentleMACS. Eseguire il programma gentleMACS "h_tumor_01".
  7. Staccare il tubo gentleMACS C dal dissociatore e incubare il campione per 30 min a 37 ° C in rotazione continua utilizzando il rotatore tubo MACSmix sulla velocità massima corsa (12 rpm) o ruotando il tubo manualmente ogni 5 minuti per risospendere frammenti di tessuto regolate .
  8. Fissare gentleMACS tubo C a testa in giù sulla manica della tegli gentleMACS dissociatore ed eseguire il programma gentleMACS "h_tumor_02".
  9. Staccare il tubo gentleMACS C dal dissociatore e incubare il campione per 30 min a 37 ° C in rotazione continua utilizzando il rotatore tubo MACSmix sulla velocità massima corsa (12 rpm) o ruotando il tubo manualmente ogni 5 minuti per risospendere frammenti di tessuto regolate .
  10. Fissare gentleMACS tubo C a testa in giù sulla bussola del dissociatore gentleMACS ed eseguire il programma gentleMACS "h_tumor_03".
  11. Staccare il tubo gentleMACS C dal campione dissociatore, risospendere e applicare la sospensione cellulare ad un filtro 70 micron cella posta su un tubo da 50 ml. Se intasamento del filtro avviene, mescolare sospensione cellulare con una punta sterile filtro fino alla completa sospensione attraversava.
  12. Sciacquare filtro cella con 5 ml di mezzo Quantum 263.
  13. Opzionale: se avete ancora frammenti di tessuto rimasti nel filtro, frammenti risospendere in mezzo Quantum 263 e semi in una cultura display appropriato cellulareh. Frammenti incubare a 37 ° C e 5% di CO 2.
  14. Eliminare filtro cella e chiudere il tubo da 50 ml con la sospensione cellulare digerito. Centrifugare sospensione di cellule per 5 minuti a 300 xg ed eliminare il surnatante.
  15. Opzionale: se la cella pellet viene visualizzato in rosso a causa di una elevata quantità di eritrociti preparare 1x Red Cell Lysis Solution sangue diluendo 1:10 soluzione 10x in acqua bidistillata, risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di PBS e si aggiungono 5 ml di 1x Red Lysis Globulo Soluzione. 5 sec vortice e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Centrifugare per 5 minuti a 300 xg ed eliminare il surnatante.
  16. Risospendere le cellule tumorali con Quantum 263 e semi le cellule in coltura cellulare pallone adeguato. Cellule tumorali Cultura a 37 ° C e 5% di CO 2 e di routine delle cellule di passaggio quando raggiungono l'80% confluenza.

3. Caratterizzazione di coltura cellulare primaria e deplezione dei fibroblasti

  1. Analizzare coltura primaria cellule fenotipicamente utilizzando un microscope.
  2. Raccogliere una piccola quantità (0.5x 10 6 celle) della coltura cellulare primaria ed eseguire RT-PCR con primer per-neoplastiche, melanoma, cellule staminali-e geni marcatori delle cellule dello stroma. I geni più importanti da analizzare sono CD90 (marcatore dei fibroblasti), TYR (melanoma / marcatore melanociti), CD133 (marcatore delle cellule staminali del cancro), CD83 (marcatore di cellule dendritiche mature) e un gene housekeeping (ad esempio HPRT o GAPDH).
  3. Se l'analisi microscopica e alta espressione di CD90 Durante la RT-PCR ha rivelato una elevata contaminazione della cultura melanoma primitivo con fibroblasti, è necessario esaurire fibroblasti con gli Anti-Fibroblasti microsfere e colonne D da Miltenyi.

4. Di separazione delle cellule CD133 + magnetica e CD133 - cellule di melanoma utilizzando colonne LS

  1. Preparare MACS tampone contenente 2 mM EDTA e il 5% FCS in PBS. Miscelare invertendo e tampone sterile, filtrato con un micron 0,22 Steritop-GP Unità di filtro. Freddo del tampone a 4-8 ° Ce Degas prima dell'uso.
  2. Preriscaldare Accutase, PBS e Quantum medie 263-37 ° C.
  3. Lavare 80% cellule confluenti con PBS. Aggiungere la quantità appropriata di Accutase e incubare cellule fino staccarsi dalla superficie cultura. Raccogliere le cellule in una provetta da 50 ml usando Quantum media 263.
  4. Determinare il numero di cellule e centrifugare il numero di cellule (secondo il protocollo Miltenyi di un numero massimo di 2x 10 9 cellule possono essere caricati per colonna LS. Linea cellulare numeri specifici ottimale dovrebbe essere determinata e può essere notevolmente inferiore.) Per 5 min a 300 xg e 4-8 ° C. Aspirare il surnatante completamente.
  5. Risospendere un massimo di 1x 10 8 cellule con 350 microlitri di buffer MACS (per il numero di cellule superiore scalare tutti i buffer successivo MACS, reagente FcR blocco, CD133/1-Biotin e anti-biotina microsfere volumi di conseguenza).
  6. Aggiungere 100 Reagente FcR blocco.
  7. Aggiungere 50 microlitri CD133/1-Biotin. Mescolare bene con un vortice e incubare a 4-8 ° C fo 10 min.
  8. Lavare le cellule aggiungendo 10 ml tampone MACS e centrifugare per 5 min a 300 xg e 4-8 ° C. Aspirare il surnatante completamente.
  9. Ripetere il passaggio di lavaggio (4.8)
  10. Risospendere il pellet di cellule con 400 microlitri di buffer MACS.
  11. Aggiungere 100 ml anti-biotina microsfere. Mescolare accuratamente con un vortex e incubare a 4-8 ° C per 15 min.
  12. Nel frattempo, preparare il separatore MACS per la separazione magnetica. Fissare QuadroMACS a Separator MACS supporto Multi. Inserire il numero di colonne LS con le ali colonna al fronte nel campo magnetico del QuadroMACS. Inserire un pre-filtro di separazione (30 mesh con um nylon) in ciascuna colonna LS ed un tubo di raccolta appropriato (15 ml o 50 ml) sotto ciascuna colonna. Preparare filtro e colonna risciacquo con 3 ml di tampone MACS. Scartare a flusso continuo.
  13. Lavare le cellule aggiungendo 10 ml tampone MACS e centrifugare per 5 min a 300 xg e 4-8 ° C. Aspirare il surnatante completamente.
  14. Risospendere le cellule con 500 microlitriMACS tamponare e applicare sospensione cellulare nella colonna LS con il Pre-filtro di separazione.
  15. Lavare tre volte con 3 ml di tampone per colonna MACS. Solo aggiungere nuovo buffer quando il serbatoio colonna è vuota.
  16. La residua raccolta contiene il totale senza etichetta CD133 - frazione di cellule.
  17. Gettare il pre-filtro di separazione, rimuovere colonna dal separatore e posizionarlo su un tubo di raccolta adeguato.
  18. Applicare 5 ml di tampone MACS. Sciacquare immediatamente le cellule CD133 + marcati con fermezza spingendo lo stantuffo nella colonna.
  19. Per aumentare la purezza della frazione negativa, applicare sospensione cellulare in una nuova colonna LS equilibrata inserito nel QuadroMACS. L'effluente contiene il CD133 - frazione.
  20. Elimina colonne.

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Risultati

Preparazione di singole cellule di tessuto tumorale

La figura 2 esemplifica una metastasi linfa resecata nodo di un paziente prima fase tardiva melanoma (A) e dopo (B) meccanica dissociazione in 2-4 pezzi millimetri. Seguendo dissociazione enzimatica del tessuto e filtrazione attraverso una maglia di nylon 70 pm, cellule sono state pellettizzate e il supernatante scartato. In questa fase abbiamo osservato un'elevata contaminazione con eritrociti come indicato dal colore ros...

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Discussione

Al fine di rimuovere contaminazioni eritrocitari dal pellet cellulare tumorale si consiglia di utilizzare la soluzione di globuli rossi del sangue lisi da Miltenyi. I vantaggi di lisare gli eritrociti rispetto alla tradizionale centrifugazione in gradiente di densità Ficoll sono che è più veloce e più semplice. Inoltre, contaminazioni con Ficoll o globuli rossi e la perdita di cellule tumorali sono evitati. Quando si osserva la crescita dei fibroblasti in coltura cellulare primaria devono essere rimossi immediatamente, ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano il Prof. M. Dietel e Dirk Schumacher per sostenere questo lavoro e criticamente la lettura del manoscritto.

La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto il sostegno del innovativi in ​​materia di medicinali impresa comune ai sensi della convenzione di sovvenzione n ° 115234, le risorse di cui sono composte di partecipazione finanziaria del Settimo programma quadro dell'Unione europea (FP7/2007-2013) e le imprese 'in dell'EFPIA contributo di natura. Questo lavoro è stato supportato anche dal Krebsgesellschaft Berliner (BKG).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagente
Accutase PAA Laboratories GmbH L11-007
Amfotericina B soluzione 250 mg / ml in acqua deionizzata Sigma-Aldrich, Inc. A2942-50ml
anti-fibroblasti microsfere Miltenyi Biotec GmbH 130-050-601
CD133 / 1 (W6B3C1) Miltenyi Biotec GmbH 130-092-395
Collagenasi IV Sigma-Aldrich, Inc. C5138
DNasi I , Ltd A3778.0050
D-PBS senza Ca, Mg PAA Laboratories GmbH H15-002
Etilendiammintetraacetato sale disodico diidrato (EDTA) Sigma-Aldrich, Inc. E-7889
FBS Superior Biochrom S0615
Indiretta CD133 Micro-Bead Kit umano Miltenyi Biotec GmbH 130-091-895 Include: CD133 / 1 (AC133)-biotina, anti-biotina microsfere e il reagente FcR blocco
Penicillina-Streptomicina, liquido (100x) Invitrogen GmbH 15140-122
Quantum 263 PAA Laboratories GmbH U15-815
Blood Red Cell Lysis Solution (10x) Miltenyi Biotec GmbH 130-094-183
Attrezzatura
Cell filtro (70 micron) BD Biosciences 352350
gentleMACS C Tubi Miltenyi Biotec GmbH 130-093-237
gentleMACS dissociatore Miltenyi Biotec GmbH 130-093-235
MACS Separator Supporto Multi Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
Colonne di separazione MACS 25 colonne LS Miltenyi Biotec GmbH 130-042-401
MACSmix Tubo Rotator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-753
Natriumchloride Merck KGaA 567440-1KG
Pre-Filtri di separazione Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407
QuadroMACS separatore Miltenyi Biotec GmbH 130-090-976
Rotilabo-siringa filtri (0.22 micron, PSE) Carl Roth GmbH & Co. KG P668.1
Steritop-GP filtro 500 ml Miltenyi Biotec GmbH SCGPS05RE

Riferimenti

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