Electrotaxis microfluidica-based per On-demand analisi quantitativa della<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

Justin Tong; Pouya Rezai; Sangeena Salam; P. Ravi Selvaganapathy; Bhagwati P. Gupta

doi:10.3791/50226

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Articolo metodologico

Electrotaxis microfluidica-based per On-demand analisi quantitativa della

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DOI:

10.3791/50226

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2 maggio 2013

Justin Tong¹ , Pouya Rezai² , Sangeena Salam¹ , P. Ravi Selvaganapathy² , Bhagwati P. Gupta¹

¹Department of Biology, McMaster University , ²Department of Mechanical Engineering, McMaster University

In questo articolo

Sommario

Un metodo di micro-elettro-fluidico semiautomatico per indurre on-demand locomozione in Caenorhabditis elegans È descritto. Questo metodo si basa sul fenomeno neurofisiologico di vermi che rispondono a campi elettrici lievi ("electrotaxis") all'interno di canali microfluidica. Microfluidica electrotaxis serve come una tecnica rapida, sensibile, a basso costo, e scalabile per lo screening per i fattori che incidono sulla salute neuronale.

Abstract

Le nematode Caenorhabditis elegans è un organismo modello versatile per la ricerca biomedica causa della sua conservazione dei geni correlati alla malattia e percorsi così come la sua facilità di coltivazione. Diversi C. modelli di malattia elegans sono state riportate, comprese malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson (PD), che comporta la degenerazione dopaminergica (DA) neuroni ^1. Entrambi i transgeni e prodotti chimici neurotossici sono stati utilizzati per indurre DA neurodegenerazione e conseguenti difetti di movimento a Worms, consentendo indagini sulla base della neurodegenerazione e schermi per i geni neuroprotettivi e composti ^2,3.

Schermi in eucarioti inferiori come C. elegans forniscono un mezzo efficace ed economico per identificare i composti ed i geni che influenzano la segnalazione neuronali. Schermi tradizionali sono in genere eseguita manualmente e ha ottenuto mediante ispezione visiva, di conseguenza, essi sono ora-consUming e soggetto a errori umani. Inoltre, la maggior attenzione per l'analisi livello cellulare, ignorando locomozione, che è un parametro particolarmente importante per i disturbi del movimento.

Abbiamo sviluppato un sistema di screening microfluidica romanzo (Figura 1) che controlla e quantifica C. locomozione elegans 'utilizzando stimoli di campo elettrico all'interno di microcanali. Abbiamo dimostrato che un campo di corrente continua (DC) può indurre robustamente on-demand locomozione verso il catodo ("electrotaxis") ^4. Inversione di polarità del campo fa sì che il verme di invertire rapidamente la sua direzione. Abbiamo anche dimostrato che i difetti nei neuroni sensoriali dopaminergici e altri alterano la risposta nuoto ^5. Pertanto, anomalie nella segnalazione neuronali possono essere determinate utilizzando locomozione come read-out. La risposta movimento può essere quantificato con precisione utilizzando una serie di parametri quali la velocità di nuoto, corpo frequenza flessione e tempo di inversione.

4. Questi risultati ci hanno portato a progettare un nuovo dispositivo microfluidica per ordinare passivamente vermi per età e fenotipo ^6.

Abbiamo anche testato la risposta dei vermi a impulsi DC e alternata (AC), campi elettrici di corrente. Campi DC pulsate di vari cicli di lavoro effettivamente electrotaxis generati sia in C. elegans e il suo cugino C. briggsae ^7. In un altro esperimento, simmetriche campi AC con frequenze che vanno da 1 Hz a 3 KHz immobilizzate vermi all'interno del canale ^8.

Realizzazione del campo elettrico in un ambiente microfluidica consente l'esecuzione rapida e automatizzata del test electrotaxis. Questo approccio promette di facilitare schermi genetiche e chimiche ad alto throughput per i fattoriche interessano la funzione neuronale e vitalità.

Protocollo

1. Fotolitografia per Mold Fabrication Maestro

Fare il bagno a 3 pollici wafer di silicio in acetone per 30 secondi e poi metanolo per 30 sec. Risciacquare con dH ₂ 0 acqua per 5 min.
Asciugare la superficie del wafer con una pistola ad aria compressa N2. Riscaldare il wafer su una piastra calda a 140 ° C per 2 min.
Plasma ossidare la superficie del wafer di silicio (1 min, 50 W).
Spin-coat superficie del wafer con 3 ml SU-8 100 fotoresist (40 sec; 1,750 rpm).
Pre-cuocere il wafer rivestito su una piastra riscaldante a 65 ° C per 10 min, quindi accelerazione la temperatura fino a 95 ° C in 2 min. Mantenere questa impostazione per un ulteriore 1 hr.
Allineare una photomask con il motivo canale desiderato. Esporre il resistere a 550-600 mJ / cm ² di luce UV (350-400 nm). Fotomaschere possono essere progettati in AutoCAD e stampati su un acetato con stampa ad alta risoluzione.
Post-cuocere il wafer su una piastra riscaldante a 65 ° C per 1 min e 95 ° C per 10 min, rampa tegli temperatura come prima.
Immergere il wafer in SU-8 soluzione di sviluppo per 10-15 min. Verificare il completamento dello sviluppo mediante risciacquo con isopropanolo. Se compare un precipitato bianco, continuare a sviluppare. Lo stampo master è mostrato in Figura 2A.

2. Litografia soft per Fabrication Microchannel

Miscelare 35 ml di polidimetilsilossano (PDMS) base di elastomero con 3,5 ml di PDMS agente indurente.
Mettere lo stampo maestro fabbricato (modello rivolto verso l'alto) e di un wafer di silicio vuoto in piastre di Petri rivestite con un foglio di alluminio.
Versare 20 ml PDMS prepolimero nel piatto stampo master e 15 ml nel secondo piatto. Eliminare le sacche d'aria sotto i wafer premendo delicatamente su di loro con un applicatore di legno monouso.
Coprire entrambi i piatti e mettere da parte per un giorno per curare. In alternativa, per la polimerizzazione veloce, rimuovere le bolle d'aria dal PDMS utilizzando degassificante vuoto e poi lasciare i piatti su una piastra riscaldante a 80 ° C per 2hr.
Togliere la pellicola e la buccia del PDMS dai wafer.
Utilizzare la Harris Uni-Core (2,5 mm) a pugni le porte di accesso fluido a entrambe le estremità del canale. Tagliare il canale e vuoto PDMS in strisce di dimensioni simili.
Caricare il canale, il PDMS striscia in bianco e un vetrino (75 × 25 mm ²⁾ in un ossidante plasma, probabilmente situato in una camera sterile. Esporre a plasma di ossigeno per 40 sec a 40 W di potenza.
Attaccare il pezzo canale e vetrino a lati opposti della striscia in bianco. Mettere da parte per 2 ore per completare il legame.
Posizionare il gruppo su un piatto caldo a 120 ° C. Collegare il tubo di plastica (diametro interno 1/32 ", diametro esterno 3/32"), ciascuna di almeno 6 pollici di lunghezza, ai serbatoi punzonati con PDMS pre-polimero. Apporre un connettore di plastica fluidico ad una o entrambe le tube di consentire attaccamento siringa o usare accessori disponibili in commercio.
Lasciare che il PDMS fissaggio del tubo di curare. Inserire 3 "lunghezze di 22 gauge filo di rame isolato in each serbatoio, tra il tubo di ingresso e il canale, e fissare con PDMS prepolimero. Il prodotto finito è mostrato nella figura 2B.

3. Electrotaxis Experiment

Collocare il microcanali sulla fase (preferibilmente XY-mobile) di un microscopio con una telecamera montata collegata ad un monitor (Figura 1).
Collegare l'alimentazione o cavi di uscita dell'amplificatore di elettrodi del microcanali di. Un semplice alimentatore DC è sufficiente se si desidera solo un segnale DC, ma un amplificatore collegato ad un generatore di funzioni permette l'applicazione di impulsi DC e segnali CA pure.
Collegare il tubo di uscita del microcanali di una siringa monouso. Immergere la bocca del tubo di ingresso nella M9 tampone fisiologico e delicatamente aspirano liquido nel canale applicando una pressione negativa all'interno della siringa (manualmente o utilizzando una pompa a siringa). Quando i tubi di ingresso e di uscita sono entrambe piene di M9, staccare la siringa from del tubo. Livellare entrambi i tubi alla stessa altezza per impedire il flusso idrostatica comandata.
Applicare una tensione continua al canale e garantire che la resistenza (R = V / I) è di circa 0,6 MW (per una lunga 50 mm, 0.3 mm di larghezza e 0,1 millimetri ~ microcanali profondità).
Se si è soddisfatti con l'integrità del canale, seguire la procedura per caricare i vermi da una sospensione diluita nel canale.
Staccare la siringa e idrostatico manipolare il flusso regolando altezza relativa dei neon. Utilizzare questo metodo per posizionare un verme al centro del canale e poi stendere entrambi i tubi piatta alla stessa altezza.
Impostare la tensione di alimentazione alla tensione appropriata: 4-12 V / cm per gli animali fase L3, 4-10 V / cm per L4S e 2-4 V / cm per i giovani adulti. Attivare il segnale elettrico e permette 1 min di pre-esposizione per il worm per acclimatarsi al campo. Il verme dovrebbe iniziare a muoversi verso il catodo. Quando il minuto è passato, utilizzare la fotocamera per avviare la registrazione.
Per AC e polsoesperimenti d DC, il campo elettrico reattivo massimo può essere adottato dal ciclo del segnale sopra e frequenza e di servizio può essere modulata come desiderato ^{7, 8.}
Quando esperimento è finito, rimuovere tutto il liquido (e vermi) dal canale, sciacquarlo con dH ₂ 0, e lasciare il dispositivo su una piastra riscaldante a 125 ° C per asciugare.
Estrarre dati locomotore da video registrati manualmente utilizzando NIH ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) o software di monitoraggio verme MATLAB-based personalizzato.