La profilazione dei metaboliti non mirati mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata con spettrometria di massa (UPLC-MS) è una tecnica potente per studiare il metabolismo. Questo articolo descrive un flusso di lavoro tipico utilizzato per la profilazione dei metaboliti non mirati del siero, tra cui l'organizzazione e la preparazione dei campioni, l'acquisizione dei dati, l'analisi dei dati, il controllo di qualità e l'identificazione dei metaboliti.
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Articolo metodologico
Su larga scala e non mirato Profiling Metabolomica di siero da Ultra Performance Liquid Chromatography-Spettrometria di Massa (UPLC-MS)
In questo articolo
Sommario
Abstract
La profilazione dei metaboliti non mirati mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata con spettrometria di massa (UPLC-MS) è una tecnica potente per studiare il metabolismo. L'approccio offre un'analisi imparziale e approfondita che può consentire lo sviluppo di test diagnostici, nuove terapie e approfondire la nostra comprensione dei processi patologici. La diversità chimica intrinseca del metaboloma crea sfide analitiche significative e non esiste un unico approccio sperimentale in grado di rilevare tutti i metaboliti. Inoltre, la variazione biologica nel metabolismo individuale e la dipendenza del metabolismo da fattori ambientali richiedono un numero elevato di campioni per raggiungere la potenza statistica appropriata necessaria per un'interpretazione biologica significativa. Per affrontare queste sfide, questo tutorial delinea un flusso di lavoro analitico per la profilazione di metaboliti non mirati su larga scala del siero mediante UPLC-MS. La procedura include linee guida per l'organizzazione e la preparazione dei campioni, l'acquisizione dei dati, il controllo di qualità e l'identificazione dei metaboliti e consentirà un'acquisizione affidabile dei dati per esperimenti di grandi dimensioni e fornirà un punto di partenza per i laboratori che non conoscono la profilazione dei metaboliti non mirati mediante UPLC-MS.
Introduzione
Il termine "metabolomica" può comprendere molte cose. Ad esempio, un esperimento di metabolomica può essere eseguito utilizzando una varietà di piattaforme analitiche come la risonanza magnetica nucleare e la cromatografia gassosa e/o liquida abbinata alla spettrometria di massa. Inoltre, gli esperimenti di metabolomica possono essere eseguiti in modo mirato o non mirato, o in una combinazione di entrambi. Un esperimento di metabolomica mirata comporterà l'analisi diretta di un pannello di molecole importanti per la questione biologica in questione (ad esempio, piccole molecole coinvolte nel ciclo TCA consentiranno una quantificazione accurata di tale via)....
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Protocollo
1. Esempio di organizzazione
- Per creare una mappa delle piastre per la preparazione dei campioni su un foglio di calcolo, nella prima colonna inserire un elenco di campioni in ordine di caricamento. In una seconda colonna, inserisci le posizioni delle piastre a 96 pozzetti utilizzando la nomenclatura corretta per il tuo software di autocampionamento.
- Conservare un pozzetto in ogni piastra per i campioni QC.
- Se l'autocampionatore LC è in grado di gestire due piastre alla volta, separare l'elenco dei campioni in lotti di 190 e salvare queste informazioni in un secondo foglio di lavoro.
- All'interno di ciascuno di questi batch, ut....
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Risultati
I passaggi analitici di base di un esperimento di profilazione metabolica non mirata mediante UPLC-MS sono illustrati nella Figura 1. I dati grezzi per ogni campione possono essere visualizzati come un cromatogramma del picco di base. La Figura 2 mostra un esempio di cromatogramma del picco di base di un campione di siero analizzato mediante l'opzione di gradiente (a) riportata nel tutorial. Dopo l'analisi statistica descritta in precedenza, si tenta l'identificazione dei metaboliti per .......
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Discussione
Questo tutorial vuole servire come punto di partenza per condurre la profilazione dei metaboliti non bersaglio su larga scala mediante UPLC-MS. Il flusso di lavoro è focalizzato sui metaboliti che possono essere estratti con un solvente acquoso di metanolo, trattenuti su una colonna UPLC C8 o C18 e rilevati come ioni positivi. Nella situazione in cui non esiste un pregiudizio predeterminato verso una specifica classe di metaboliti e si desidera un'ipotesi che generi un profilo globale, questo protocollo è prezioso in qua.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Il tutorial presentato è stato eseguito e sviluppato all'interno della Proteomics and Metabolomics Facility presso la Colorado State University, che è parzialmente finanziata dalla CSU Research Administration Resources for Scholarly Projects.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastre a 96 pozzetti - 500 μ pozzetti | VWR | 40002-020 | Questi sono utilizzati per la preparazione del campione |
| Tappetini per piastre a 96 pozzetti | VWR | 89026-514 | Questi sono utilizzati per la preparazione del campione |
| Piastre a 96 pozzetti - 350 μ l pozzi | Waters Corporation | WAT058943 | Questi sono utilizzati per l'iniezione di campioni |
| Tappetini per piastre a 96 pozzetti | Waters Corporation | 186000857 | Questi sono utilizzati per l'iniezione di campioni |
| Termosigillature per piastre a 96 pozzetti | Waters Corporation | 186002789 | Questi possono essere utilizzati per l'iniezione di campioni o per la conservazione a lungo termine |
| Termosigillatrice per piastre a 96 pozzetti | Waters Corporation | 186002786 | |
| Metanolo di grado LC-MS | Fluka | 34966 | |
| Acetonitrile di grado LC-MS | Fluka | 34967 | |
| grado LC-MS | Fluka | 39253 | |
| Acido formico di grado LC-MS | Fluka | 56302 | |
| Pipettatore elettronico multicanale | VWR | 89000-674 | |
| Puntali Pipett | Eclipse (acquistati tramite Light Labs) | B-5061/B-4061 | |
| Centrifuga refrigerata - Allegra X-12R | Beckman Coulter | N/A - contatto Beckman Coulter | |
| Acquity Sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni (UPLC) | Waters Corporation | N/A - contatto Waters Corporation | |
| Colonna UPLC C8 (opzione gradiente a) | Waters Corporation | 186002876 | |
| colonna UplC T3 (opzione gradiente b) | Waters Corporation Corporation | 186003536 | |
| Spettrometro di massa Xevo G2 Q-TOF | Waters Corporation | N/A - contattare Waters Corporation |
Riferimenti
- Theodoridis, G., Gika, H. G., Wilson, I. D. Mass Spectrometry-Based Holistic Analytical Approaches for Metabolite Profiling in Systems Biology Studies. Mass Spectrom. Rev. 30, 884-906 (2011).
- Zelena, E., et al.
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Ristampe e permessi
