RNA Secondaria previsione della struttura utilizzando la forma di alta velocità

Sommario

High-throughput selettivo 2 'acilazione idrossile analizzato da primer extension (SHAPE) utilizza un romanzo chemical probing tecnologia, la trascrizione inversa, elettroforesi capillare e software di predizione della struttura secondaria per determinare le strutture di RNA da diverse centinaia a diverse migliaia di nucleotidi a singolo nucleotide risoluzione.

Abstract

Comprendere la funzione di RNA coinvolti in processi biologici richiede una conoscenza approfondita della struttura dell'RNA. A questo fine, la metodologia denominata "2 selettivo high-throughput 'acilazione idrossile analizzato da primer extension", o la forma, permette la previsione di RNA struttura secondaria con risoluzione singolo nucleotide. Questo approccio utilizza agenti chimici che probing acilato preferenzialmente singole regioni o flessibile filamento di RNA in soluzione acquosa. Siti di modificazione chimica vengono rilevati mediante trascrizione inversa del RNA modificati, ed i prodotti di questa reazione sono frazionati mediante elettroforesi capillare automatizzato (CE). Dal momento che la transcriptasi inversa si ferma a quei nucleotidi di RNA modificati dai reagenti SHAPE, la libreria di cDNA risultante indirettamente associa quei ribonucleotidi che sono a singolo filamento nel contesto delle RNA piegati. Utilizzando il software ShapeFinder, i elettroferogrammi prodotti dalla automatizzato CE vengono elaborati e convertiti in nutavoli reattività cleotide che sono a loro volta convertiti in vincoli pseudo-energetiche utilizzate nel RNAStructure (V5.3) algoritmo di predizione. Le strutture di RNA bidimensionali ottenute combinando SHAPE sondando con in silico RNA predizione della struttura secondaria sono stati trovati per essere molto più preciso di strutture ottenute utilizzando il metodo da solo.

Introduzione

Per capire le funzioni di RNA catalitici e non codificanti coinvolti nella regolazione dello splicing, la traduzione, la replicazione del virus e il cancro, una conoscenza dettagliata della struttura dell'RNA è richiesto ^1,2. Purtroppo, la previsione accurata di RNA folding rappresenta una sfida formidabile. Agenti di sondaggio classici soffrono molti svantaggi come la tossicità, incompleta copertura dei nucleotidi e / o velocità limitata a 100-150 nucleotidi per esperimento. Senza aiuto secondarie algoritmi di predizione di struttura sono allo stesso modo svantaggioso, a causa di imprecisioni derivanti dalla loro incapacità di distinguere efficacement....

Protocollo

Progettazione Primer e l'estensione del capolinea del RNA 3 '

Per analizzare lunghi RNA da SHAPE ad alta produttività, una serie di siti di ibridazione del primer deve essere selezionata in modo tale che (i) sono separati da ~ 300 nt, (ii) sono 20-30 nt di lunghezza, e (iii) che il RNA / ibridi DNA prodotto da DNA ricottura a questi siti hanno una temperatura di fusione previsto> 50 ° C. Inoltre, i segmenti di RNA che si prevede di essere prevalentemente strutturate dovrebbero essere evitati, anche se procedere a tale constatazione richiede alcune preconoscenza della struttura di RNA, che spesso non è disponibile. Primer di DNA che i....

Risultati

RNA contenente il virus HIV-1 rev risposta elemento (RRE) ea 3 'terminale cassetta struttura ⁴ è stato preparato da un plasmide linearizzato mediante trascrizione in vitro, dopo di che è stato piegato da riscaldamento, raffreddamento e incubazione a 37 ° C in presenza di MgCl _2. RNA è stato esposto a NMIA e poi invertire trascritto da un primer di DNA 5'-end-marcato ibridato a cassetta struttura terminale 3 '. La libreria di cDNA risultante SHAPE, insieme a reazioni di controll.......

Discussione

Presentiamo qui un protocollo dettagliato per la forma ad alta velocità, una tecnica che permette la determinazione della struttura secondaria a risoluzione singolo nucleotide di RNA di qualsiasi dimensione. Inoltre, abbinando i dati di forme sperimentali con secondari algoritmi di predizione di struttura facilita la generazione di modelli di RNA in 2D con un maggior grado di precisione di quanto sia possibile con uno dei due metodi da solo. La combinazione di primer fluorescenza marcata e automatizzato CE offre signifi.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
REAGENTS
N-methylisatoic anidride (NMIA)	Life technologies	M25	Dissolve in DMSO anidro
anidride 1-metil-t-nitroisatoica (1M7)	vedi ref. 22
Superscript III Reverse Transcriptase	Life technologies	18080044	10.000 unità
Kit di sequenziamento del ciclo della termosequenziasi	Affymetrix	78500
Materiali forniti dall'utente
RNA di interesse			6 pmol per reazione (il limite di rilevabilità sarà determinato dallo strumento)
Set di quattro primer marcati da 5' (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 e WellRed D1/Licor IR800)			I primer sono complementari all'RNA e vengono utilizzati nelle reazioni di trascrizione inversa e sequenziamento. I fluorofori elencati sono ottimali per il Beckman Coulter 8000 CEQ. I primer possono essere acquistati o sintetizzati in casa.
Il DNA stampo			viene utilizzato per le reazioni di sequenziamento e deve contenere la sequenza dell'RNA oggetto di studio, compresa l'eventuale estensione 3'terminale, se presente. Ove applicabile, è spesso conveniente utilizzare il modello di trascrizione dell'RNA.
Buffers
10x Tampone			100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M KCl, 1 mM EDTA
5X Tampone			200 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM MgCl2, 2.5 mM EDTA, 650 mM KCl. (Questo tampone potrebbe essere modificato a seconda del caso (es. pH, EDTA, Mg, inibitore della RNasi)
2,5X RT miscela			4 μ l 5X buffer, 1 μ l 100 mM DTT, 1,5 μ l. acqua,1 μ l 10 mM dNTP, 0,5 μ l Apice III. Si noti che il buffer 5X e 100 mM DTT vengono forniti con l'acquisto di SuperScript III (Invitrogen).
Soluzione di caricamento dei campioni GenomeLab (Beckman Coulter)			Attenzione: Evitare cicli multipli di congelamento-scongelamento
EQUIPMENT
Elettroforesi capillare	Beckman	CEQ8000
Thermocycler	varia

di rinaturazione dell'RNA di ripiegamento dell'RNA