Un metodo preciso, corto, sofisticato ed economico è descritto che valuta la lunghezza dei telomeri nei diversi tessuti e specie utilizzando RT-PCR quantitativa. Inoltre, descriveremo un semplice test per valutare l'attività della telomerasi come test dorsale complementare per la lunghezza dei telomeri.
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Articolo metodologico
Lunghezza dei telomeri e telomerasi attività; Un Yin e Yang di senescenza cellulare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Telomeri ripetono sequenze di DNA alla estremità di punta dei cromosomi che sono diverse in lunghezza e nell'uomo può raggiungere una lunghezza di 15.000 coppie di basi. Il telomero serve come meccanismo bioprotettivi del cromosoma logoramento ad ogni divisione cellulare. A una certa lunghezza, i telomeri diventano troppo corti per consentire la replica, un processo che può portare ad instabilità cromosomica o morte cellulare. La lunghezza dei telomeri è regolato da due meccanismi opposti: logoramento e allungamento. Attrito si verifica come ogni cellula si divide. In contrasto, l'allungamento è parzialmente modulato dal enzima telomerasi, che aggiunge le sequenze ripetute alle estremità dei cromosomi. In questo modo, telomerasi potrebbe eventualmente invertire un meccanismo di invecchiamento e ringiovanisce vitalità cellulare. Questi sono elementi cruciali per il mantenimento della vita cellulare e sono utilizzati per valutare l'invecchiamento cellulare. In questo manoscritto si descrivono un accurato breve sofisticato ed economico metodo per valutare la lunghezza dei telomeri nel tessuto multiplas e specie. Questo metodo sfrutta due elementi fondamentali, il tandem ripetizione della sequenza telomero e la sensibilità del qRT-PCR per rilevare differenziali numeri di copie di campioni esaminati. Inoltre, descriveremo un semplice test per valutare l'attività della telomerasi come test dorsale complementare per la lunghezza dei telomeri.
Introduzione
I telomeri stanno ripetendo DNA esamero (TTAGGG) sequenze trovati alle estremità dei cromosomi. In ogni replicazione cellulare, queste estremità cromosomiche sono accorciati. Se diventano troppo corti, i cromosomi possono subire fusioni telomeri finali, ricombinazione aberrante, e il degrado. Così sufficiente lunghezza dei telomeri manutenzione gioca un ruolo importante nella stabilità cromosomica e la protezione delle cellule 38. Manutenzione lunghezza dei telomeri è fondamentale anche per i geni trovati vicino le estremità dei cromosomi, in quanto la replicazione del DNA non può continuare fino alla fine dei cromosomi 1-2. Conseguentemente, la....
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Protocollo
1. Telomere Lunghezza protocollo 19
- Estrazione del DNA
Possono essere utilizzate La maggior parte dei metodi di isolamento del DNA. Il nostro laboratorio preferisce Qiagen Kit DNeasy (# 69506) per le fonti di sangue. A seconda della fonte di DNA, come fonti di buccali o altro, può essere utilizzato un metodo di isolamento differente.
- Primers:
Tutti i primer sono diluiti ad una concentrazione di magazzino 100pmoles/μl PCR in acqua di grado e conservati a -20 ° C fino all'utilizzo. Scorte di lavoro dei primer sono fatti freschi e vengono conservati a 2....
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Risultati
Un esempio di una lunghezza saggio RT-PCR quantitativa telomeri è mostrato in Figura 1. Sul pannello superiore sinistro, campioni etichettati in rosso e verde rappresentano la posizione dei soggetti testati sulla piastra a 96 pozzetti. Sul pannello superiore destro, la curva di amplificazione è dimostrato. Ogni oggetto è testato da due saggi (telomeri e singola copia del gene), che è fatto in triplicato. A causa di diverse copie di DNA prodotti nelle due saggi di individui selezionati, il numero di cicl.......
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Discussione
La lunghezza dei telomeri fornisce un marcatore cellulare unico per studiare la cellula stressati e invecchiamento e offre approfondimenti sui meccanismi di invecchiamento. Dal momento che era stato prima suggerito il suo ruolo nel processo di invecchiamento, una moltitudine di studi sono stati fatti riguardanti la lunghezza dei telomeri di età, la longevità, la malattia legata all'età, tumori, e lo stress. Per decenni, il gold standard di misura della lunghezza dei telomeri era terminale analisi dei frammenti di re.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Rilevamento quantitativo della telomerasi | Allied Biotech | MT3012 | |
| Qiagen DNeasy Kit | Qiagen | 69506 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master, miscela di reazione di avvio a caldo pronta all'uso per la PCR in tempo reale basata su SYBR Green I utilizzando lo strumento LightCycler 480 | Roche Diagnostics | 4707516 |
Riferimenti
- Blackburn, E. H. Structure and Function of Telomeres. Nature. 350 (6319), 569-573 (1991).
- Gilson, E., Ségal-Bendirdjian, E. The Telomere Story or the Triumph of an Open-Minded. Research. Biochimie. 92 (4), 321-326 (2010).
- Wu, X., Amos, C. I., Zhu, Y., Zhao, H., Grossman, B. H., Shay, J. W.,....
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Ristampe e permessi
