Articolo metodologico

Mouse a breve e lungo termine di attività locomotoria analizzati da Tracking Software Video

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DOI:

10.3791/50252

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20 giugno 2013

 ,  ,  , 
1Department of Animal Sciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Pathology, Integrative Immunology and Behavior Program, University of Illinois at Urbana-Champaign

In questo articolo

Sommario

Attività locomotoria (LMA) è una misura semplice e di facile esecuzione di comportamento nei topi. Accoppiamento di software di video tracking (VTS) e LMA permette il miglioramento della specificità e sensibilità, soprattutto se confrontato con il manuale, linea metodo di attraversamento LMA analisi. Inoltre VTS permette il monitoraggio a lungo termine di topo LMA.

Abstract

Attività locomotoria (LMA) è una misura semplice e di facile esecuzione di comportamento nei topi e altri roditori. Miglioramenti nel software di video tracking (VTS) hanno permesso di essere accoppiato a test LMA, migliorando notevolmente la specificità e la sensibilità rispetto al metodo linea di incroci con il punteggio manuale. Inoltre, VTS permette la sperimentazione di alto-rendimento. Simile al video tracking automatico utilizzato per la prova in campo aperto (OFT), test di LMA è unica in quanto permette topi di rimanere nella loro gabbia casa e non utilizza lo stimolo ansiogeno di forte illuminazione durante la fase attiva del chiaro-scuro ciclo. Tradizionalmente, LMA è stato utilizzato per brevi periodi di tempo (minuti), mentre gli studi più lunghi del movimento (ore-giorni) hanno spesso usato impiantati trasmettitori e biotelemetria. Con l'opzione di monitoraggio in tempo reale, a lungo, come il test a breve termine LMA, possono ora essere eseguiti utilizzando videografia. Test a lungo termine LMA richiede una specializzazione, Ma facilmente costruiti, gabbia in modo che il cibo e l'acqua (che è di solito posizionato sulla parte superiore della gabbia) non osti videografia. È importante sottolineare che, videografia e VTS permette la quantificazione di parametri, come ad esempio il percorso di movimento del mouse, che sono difficili o irrealizzabile per misurare con la linea di passaggio e / o biotelemetria. In sintesi, prove LMA accoppiato ad VTS permette una descrizione più completa di movimento del mouse e la capacità di esaminare locomozione su un periodo esteso di tempo.

Protocollo

1. LMA Set a breve termine Up e procedura

  1. A breve termine LMA gabbia istituito
    1. Testare LMA a breve termine all'interno della casa gabbia di un mouse a singolo ospitato. Per facilitare l'analisi delle immagini VTS-dipendente, utilizzare biancheria da letto in alto contrasto con il colore del mouse (cioè letto di colore scuro per i topi bianchi e biancheria da letto di colore chiaro per i topi neri).
    2. Durante il test a breve termine LMA, coprire le gabbie con chiaro ¼ in plexiglas con 11 ¼ x in fori di diametro per sostenere una ventilazione adeguata.
  2. Sala prove LMA a breve termine
    1. Testare topi in un ambiente pulito in cui sono stati acclimatati per almeno 24 ore 8.
    2. Per illuminare l'ambiente di test, utilizzare chioccia luci morsetto con lampadine rosse (<125 lumen). Prima di videografia, regolare l'angolo e la posizione delle luci per eliminare il riverbero o riflessi dalla cima della gabbia di plexiglas.
    3. Rimuovere o evitare il rumore nelle cameresuperiore a 70 dB. Utilizzare un generatore di rumore bianco, se il rumore di fondo intermittente è inevitabile durante il test del mouse.
    4. Coprire la superficie di prova su cui le gabbie sono posti in sala prove con macellaio o carta da banco di laboratorio di colore simile al letto gabbia, nel caso in cui il pavimento della gabbia è esposto durante la videografia.
  3. A breve termine LMA videografia
    1. Centro e posizionare una visione notturna, capace videocamera a soffitto con almeno 120 GB di memoria al di sopra dell'area di registrazione in sala prove. Non superare la capacità di risoluzione dei VTS utilizzati mettendo troppe gabbie all'interno della videocamera telaio vista (ad esempio Ethovision XT 7 da Noldus Information Technology (Leesburg VA) possono contemporaneamente traccia 8 topi in tempo reale).
  4. Procedura di test LMA a breve termine
    1. Testare LMA a breve termine durante la fase attiva / scuro del ciclo di luce. Assicurarsi che il tempo relativo al ciclo di luce è ªe stesso in tutti i gruppi, come LMA segue un modello crepuscolare, con più attività durante i periodi iniziali e successive del ciclo di buio 1. Includere entrambi i soggetti sperimentali e di controllo in ciascun gruppo di topi registrate per garantire i potenziali effetti delle differenze temporali LMA sono ridotti al minimo.
    2. Individualmente casa e ambientarsi topi almeno 24 ore prima dell'inizio della LMA test 8.
    3. Posizionare i divisori gabbia e gabbie (contenenti singoli topi) direttamente sotto la telecamera. Rimuovere tutto il materiale di nidificazione / arricchimento dalle gabbie, in quanto ciò potrebbe ostacolare la vista del mouse (per esempio se il mouse Burrows / si copre con materiale di nidificazione) e di interferire con la precisione VTS. Mettere un coperchio trasparente in plexiglass su ogni gabbia registrato.
    4. Quando filmare diverse gabbie contemporaneamente, assicurarsi che la risoluzione sia compatibile con il VTS scelti. Per facilitare l'analisi VTS, posizionare le gabbie identiche all'interno di ogni divisore (cioè in alto a destra).
    5. Avviare la registrazione. Iniziare ogni video con una lista che identifica tutte le informazioni sperimentali pertinenti per garantire la corretta identificazione del video indipendente da qualsiasi documentazione non-video aggiuntivo. Utilizzare un timer o cronometro per monitorare la durata delle prove LMA (5-10 min). Se le informazioni di temporizzazione è persa, recuperarlo dal record di video.
    6. Per misure ripetute utilizzando il metodo LMA a breve termine, consentono topi accesso a cibo e acqua durante gli intervalli di non-misura.
    7. Durante il test, tenere eventuali sperimentatori fuori dalla vista dei topi in modo da non agire come un segnale visivo esterno.
    8. Quando il test è finito, ritorno / sostituisce materiale di nidificazione / arricchimento, per ridurre il potenziale per lo sviluppo di ansia comportamento simile 8.
  5. Analisi LMA a breve termine
    1. Conservare le registrazioni video della sessione di test su un supporto di archiviazione compatibili con il VTS utilizzati. Per Ethovision XT 7, un disco del disco rigido viene utilizzato (HDD).
    2. Riproduzione dei video nei VTS con il suo lettore multimediale associato, analizzando i video in tempo reale. In figura 1, le variabili di rilevazione sono state: 2 cm / sec inizia tracking; 1,75 centimetri / sec arresta inseguimento.
    3. Inizialmente, scegliere l'intero pavimento della gabbia, come la regione di interesse (ROI) per il monitoraggio. Per le analisi avanzate, come la valutazione di thigmotaxis, creare più ROI intra-gabbia.
    4. Per gli studi di high-throughput, analizzare tutte le gabbie all'interno del video in contemporanea con singolo piano ROI all-gabbia.
    5. Utilizzare il VTS per calcolare la distanza totale spostato (cm), velocità di movimento (cm / sec) e la durata del movimento (sec). Per Ethovision XT 7, esportare i dati generati in Microsoft Excel per la memorizzazione e l'analisi supplementare.

2. Test LMA lungo termine Set Up e procedura

  1. LMA test costruzione gabbia a lungo termine
    1. Tagliare un foro di 5,5 cm di diametro nel muro di breve terminedi una gabbia mouse standard. Creare una copertura per il foro con ¼ in maglia di acciaio zincato. Tagliare la maglia, creando parecchi ½ in aperture per permettere l'accesso del mouse per il cibo. Brunire inoltre maglie taglio per rimuovere bordi taglienti.
    2. Utilizzare maglia aggiuntiva per creare una tramoggia esterno direttamente collegato alla maglia utilizzata per coprire l'apertura 5.5 cm. Collegare la tramoggia per la maglia utilizzata per coprire il buco, e collegare il gruppo alla gabbia con rivetti in alluminio.
    3. Costruire una bottiglia d'acqua da uno standard di 50 ml (Corning) e un tappo di gomma 1 foro (Fisher) che è finita-forato per consentire l'inserimento di nessun-gocciolamento tubo sipper (Sistemi di Sta-Pure). Fissare la bottiglia d'acqua alla gabbia con il velcro (3M) e inserire il tubo sipper attraverso l'apertura coperta maglia.
    4. Durante il test di lunga durata LMA, coprire le gabbie con chiaro ¼ in plexiglas con 11 ¼ x in fori di diametro per sostenere una ventilazione adeguata.
  2. Sala prove LMA a lungo termine
    1. Sala prove LMA a lungo termine creato è identico a LMA a breve termine. Vedere la sezione 1.2 per la procedura.
  3. A lungo termine LMA videografia
    1. Centro e mettere un soffitto incasso a infrarossi, la sicurezza in stile, fotocamera direttamente collegato ad un PC sopra l'area di registrazione in sala prove. Registrare solo il numero di gabbie subito che si traduce in risoluzione gabbia individuale entro la capacità del VTS utilizzati (ad es Ethovision XT 7 può simultaneamente seguire 8 topi in tempo reale).
  4. Procedura di test LMA a lungo termine
    1. Testare LMA lungo termine durante la fase attiva / scuro del ciclo di luce. Assicurarsi che il tempo relativo al ciclo di luce è la stessa in tutti i gruppi, come LMA segue un modello crepuscolare con più attività durante i periodi iniziali e successive del ciclo di buio 1. Prova entrambi i soggetti sperimentali e di controllo in ciascun gruppo di topi registrati al fine di garantire la riduzione al minimo del potenzialeeffetti delle differenze temporali nella LMA.
    2. Individualmente casa e acclimatare i topi di prova nelle gabbie modificate, per almeno 24 ore.
    3. Posizionare i divisori gabbia e gabbie (contenenti singoli topi) direttamente sotto la telecamera. Rimuovere tutto il materiale / arricchimento nidificazione dalle gabbie per consentire una visibilità di vista del topo. Topo scavando nel materiale di nidificazione possa interferire con la capacità del VTS per tenere traccia del mouse. Posizionare un coperchio trasparente in plexiglas su ciascuna delle gabbie da registrare.
    4. Durante la registrazione di diverse gabbie in una volta, assicurarsi che la risoluzione sia compatibile con il VTS scelti. Per facilitare VTS analisi, posizione gabbie identiche all'interno di ogni divisore (cioè in alto a destra).
    5. Test a lungo termine LMA è generalmente analizzato in tempo reale, e una registrazione video non è di solito creato. Un record video può essere registrato utilizzando una fotocamera secondaria o tramite un registratore DVD collegato alla fotocamera principale. Essere sicuri di mantenere registrazioni dettagliate dei singolimouse e informazioni sul gruppo.
    6. Impostare il VTS per l'analisi in tempo reale. L'intero pavimento della gabbia dovrebbe comprendere il ROI per il monitoraggio. Impostare ROI per tutte le gabbie si sta registrando. Utilizzare il VTS per calcolare la distanza totale spostato (cm), velocità di movimento (cm / sec) e la durata del movimento (sec). Nella Figura 2, le variabili di rilevazione sono state: 2 cm / sec inizia tracking; 1,75 centimetri / sec arresta inseguimento.
    7. Iniziare a registrare il mouse lungo termine LMA. Monitorare la durata della prova lungo termine LMA tramite l'orologio associato al computer analizzando.
    8. Durante il test, mantenere tutti gli sperimentatori fuori dalla vista dei topi in modo da non agire come un segnale visivo esterno.
    9. Quando il test è finito, ritorno / sostituisce materiale di nidificazione / arricchimento, per ridurre il potenziale per lo sviluppo di ansia comportamento simile 8.
  5. Analisi LMA a lungo termine
    1. Analisi LMA lungo termine si verifica in tempo reale senza la generazione di una registrazione video. Esportare i dati in Microsoft Excel per la memorizzazione e l'analisi, se si utilizza Ethovision XT 7.
    2. Per generare una registrazione video per LMA lungo termine, utilizzare una telecamera secondaria. Assicurarsi che la fotocamera secondaria dispone di ampie capacità di archiviazione sufficiente per memorizzare la registrazione potenzialmente lungo (s).

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Risultati

Un esempio di risultati di una misure ripetute, prova LMA breve termine è mostrato in Figura 1. Questa figura mostra che, dopo lipopolisaccaride (LPS), l'amministrazione, i topi alloggiati in gabbie ventilate individualmente (IVC) recuperare l'attività locomotoria a breve termine più velocemente di topi alloggiati in ambiente ambiente ingabbiamento (AEC) 6. Mentre la perdita iniziale di attività locomotoria è simile tra LPS gruppi iniettati, il recupero di basale LMA è più rapida in I...

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Discussione

I sintomi della malattia nei topi includono letargia, perdita di interesse in un ambiente sociale e ambientale, malessere e anoressia 2-3. Nei topi e altri roditori, LMA può essere utilizzato per valutare la malattia dopo immunitario attivazione 4-5. Inoltre, LMA a lungo termine offre la possibilità di monitorare il movimento su una 24 ore (o superiore) periodo, permettendo l'analisi delle alterazioni indotte dal trattamento nel comportamento circadiano o disturbi nel sonno / veglia. LMA offre ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Supporto: Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health (DK064862, NS058525 e AA019357 di GGF).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
VideocameraSonyHDR-XR500VPotrebbero funzionare anche altre videocamere simili. Il formato di archiviazione dei file (codec/contenitore) deve essere compatibile con il VTS utilizzato. Quando si stabilisce inizialmente un VTS, si consiglia di scegliere prima il VTS e di collaborare con il fornitore nella scelta di una telecamera appropriata, soprattutto per quanto riguarda il formato del file e la compatibilità della risoluzione video.
gabbia opachirealizzati su misura in base alle dimensioni specifiche della gabbia. Per facilitare l'analisi dell'immagine, i divisori dovrebbero essere di un colore simile alla lettiera della gabbia. I divisori strutturalmente fissi sono preferibili perché velocizzano l'impostazione tra esperimenti multi-topo, come quelli che coinvolgono misurazioni ripetute. I robusti divisori a gabbia trasportabili possono essere costruiti in plastica opaca da 1/2 pollice e uniti tramite una serie di giri incrociati.
Lettiera chiara o scura (opposta al colore del mantello del topo)Disponibile presso diversi distributori di forniture per animali da laboratorio, a seconda della posizione.
Piani della gabbia in plexiglas trasparente Fabbricatisu misura in base alle dimensioni della gabbia.
Software di tracciamento video automatizzato (EthoVision XT 7)Noldus Information TechnologyEsistono diversi produttori di VTS, l'uso di altri software può essere sufficiente.
PCDell Inc.Vedere i requisiti minimi del PC per i fornitori di software VTS
Generatore di rumore biancoDohmDSÈ disponibile una varietà di generatori di rumore bianco, a seconda delle esigenze.
Luci a morsetto con lampadine rosse Diversedimensioni e stili disponibili. Il numero richiesto dipende dalle dimensioni della stanza/dalle esigenze di illuminazione. Non superare i 125 lumen nella sala prove.
Carta da banco da laboratorio o daLa carta deve corrispondere o essere di colore molto simile alla lettiera della gabbia.
Divisori a macellaio

Riferimenti

  1. Goulding, E. H., Schenk, A. K., Juneja, P., MacKay, A. W., Wade, J. M., Tecott, L. H. A robust automated system elucidates mouse home cage behavioral structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20575-20582 (2008).
  2. Kent, S., Bluthé, R. M., Kelley, K. W., Dantzer, R. Sickness behavior as a new target for drug development. Trends Pharmacol. Sci. 13, 24-28 (1992).
  3. Dantzer, R. Cytokine, sickness behavior, and depression. Immunol. Allergy Clin. North Am. 29, 247-264 (2009).
  4. Godbout, J. P., et al. Exaggerated neuroinflammation and sickness behavior in aged mice following activation of the peripheral innate immune system. FASEB J. 19, 1329-1331 (2005).
  5. York, J. M., et al. The biobehavioral and neuroimmune impact of low-dose ionizing radiation. Brain Behav. Immun. 26, 218-227 (2012).
  6. York, J. M., et al. Individually ventilated cages cause chronic low-grade hypoxia impacting mice hematologically and behaviorally. Brain Behav. Immun. 26, 951-958 (2012).
  7. Jennings, M., et al. Refining rodent husbandry: the mouse. Report of the Rodent Refinement Working Party. Lab. Anim. 32, 233-259 (1998).
  8. York, J. M., Blevins, N. A., Baynard, T., Freund, G. G. Mouse testing methods in psychoneuroimmunology. Methods in Molecular Biology. 934, 243-276 (2012).
  9. Dantzer, R., O'Connor, J. C., Freund, G. G., Johnson, R. W., Kelley, K. W. From inflammation to sickness and depression: when the immune system subjugates the brain. Nat. Rev. Neurosci. 9, 46-56 (2008).
  10. Crawley, J. N. Behavioral phenotyping of rodents. Comp. Med. 53, 140-146 (2003).
  11. Karelina, K., et al. Social isolation alters neuroinflammatory response to stroke. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 5895-5900 (2009).

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