Post-embedding Etichettatura immuno di proteine ​​sinaptiche in Culture Slice ippocampali

Sommario

La localizzazione e la distribuzione delle proteine ​​forniscono informazioni importanti per la comprensione delle loro funzioni cellulari. La superiore risoluzione spaziale di microscopia elettronica (EM) può essere utilizzato per determinare la localizzazione subcellulare di un dato antigene immunoistochimica seguito. Per tessuti del sistema nervoso centrale (CNS), preservando l'integrità strutturale mentre antigenicità mantenendo è stato particolarmente difficile in studi EM. Qui, si adotta una procedura che è stata usata per conservare le strutture e gli antigeni del sistema nervoso centrale per studiare e caratterizzare le proteine ​​sinaptiche nel ratto CA1 dell'ippocampo neuroni piramidali.

Abstract

Microscopia Immunoelectron è un potente strumento per studiare molecole biologiche a livello subcellulare. Anticorpi accoppiati elettroni dense marcatori come oro colloidale può rivelare la localizzazione e la distribuzione di antigeni specifici in vari tessuti ^1. Le due tecniche più utilizzate sono pre-embedding e post-embedding tecniche. In pre-embedding immuno-microscopia elettronica (EM) tecniche, il tessuto deve essere permeabilizzate per consentire la penetrazione di anticorpi prima di essere incorporato. Queste tecniche sono l'ideale per conservare le strutture, ma scarsa penetrazione dell'anticorpo (spesso solo i primi micrometri) è uno svantaggio notevole ^2. I post-embedding metodi di etichettatura possibile evitare questo problema perché l'etichettatura avviene su sezioni di tessuti fissati in cui gli antigeni sono più facilmente accessibili. Nel corso degli anni, una serie di modifiche hanno migliorato le post-embedding metodi per migliorare e preservare immunoreattività ultrastruttura Fissazione dei tessuti è una parte cruciale di studi EM. Fissativi chimicamente reticolare le macromolecole per bloccare le strutture di tessuto in posizione. La scelta di fissativo influenza non solo la conservazione strutturale ma anche antigenicità e contrasto. Tetrossido di osmio (OsO _4), formaldeide e glutaraldeide sono stati i fissativi standard per decenni, anche per il sistema nervoso centrale (SNC), tessuti che sono particolarmente inclini a danni strutturali durante la lavorazione chimica e fisica. Purtroppo, OsO ₄ è altamente reattivo e ha dimostrato di mascherare antigeni ^6, con conseguente etichettatura povero e insufficiente. Approcci alternativi per evitare la fissazione chimica comprendono il congelamento dei tessuti. Ma queste tecniche sono difficili da eseguire e richiedono strumentazione costosa. Per risolvere alcuni di questi problemi e di migliorare tessuto del SNC etichettatura, Phend et al. sostituito OsO ₄ con acetato di uranile (UA) e tannico acid (TA), e introdotto con successo ulteriori modifiche per migliorare la sensibilità della rilevazione dell'antigene e conservazione strutturale nel cervello e del midollo spinale ^7. Abbiamo adottato questo osmio senza post-embedding metodo al tessuto del cervello di ratto e ottimizzato la tecnica immunogold etichettatura per rilevare e studiare le proteine ​​sinaptiche.

Vi presentiamo qui un metodo per determinare la localizzazione ultrastrutturale delle proteine ​​sinaptiche nel ratto CA1 dell'ippocampo neuroni piramidali. Usiamo organotipiche fettine di ippocampo in coltura. Queste fette mantenere la circuiteria trisynaptic dell'ippocampo, e quindi sono particolarmente utili per studiare la plasticità sinaptica, un meccanismo ampiamente pensato alla base dell'apprendimento e della memoria. Organotipiche fettine ippocampali di postnatali giorni 5 e 6 di topo / ratto cuccioli possono essere preparati come descritto in precedenza ^8, e sono particolarmente utili per acutamente knockdown o esprimono molti proteine ​​esogene. Abbiamo già usato questo protocollo per characterize neurogranin (Ng), un neurone-specifica proteina con un ruolo critico nella regolazione della funzione sinaptica ^8,9. Abbiamo anche usato per caratterizzare la localizzazione ultrastrutturale di calmodulina (CaM) e Ca ^{2 +} / CaM-dipendente proteina chinasi II (CaMKII) ^10. Come illustrato nei risultati, questo protocollo permette una buona conservazione ultrastrutturale delle spine dendritiche e l'etichettatura efficiente del Ng per caratterizzare la sua distribuzione nella colonna vertebrale ^8. Inoltre, la procedura qui descritta può avere un'ampia applicabilità in studio molte altre proteine ​​coinvolte in funzioni neuronali.

Protocollo

1. Fissazione

Fissativi sono cancerogene, indossare guanti e gestire i fissativi in ​​una cappa aspirante. Se non diversamente specificato, tutte le incubazioni sono effettuate su tutte le soluzioni ghiaccio e deve essere filtrata prima dell'uso. Utilizzare microscopia elettronica di grado reagenti.

Giorno 1

1. Dopo condizioni sperimentali (ad esempio iniezione virale, trattamento farmacologico), posizionare la membrana con organotipiche fettine di ippocampo in un 60 x 15 millimetri capsula di Petri in polistirolo contenente ghiacciata 0.1 M tampone fosfato (tampone fosfato Sorensen), pH 7,3. Aggiungere 1 - 2 ml di tampone fosfato 0,1 M direttamente sopra le fette per tenerli freddo.

FASE CRITICA: utilizzare sempre freschi tamponi preparati e fissativi. Assicurarsi che il pH del tampone è nel raggio d'azione desiderato. Un fallimento in tal senso potrebbe danneggiare le strutture cellulari.

2. Per isolare il sottocampo CA1 della fetta, utilizzare unmonouso bisturi per tagliare delicatamente sulla fetta successiva alla DG, parallelo allo strato CA1 cella (Figura 1). Poi tagliare la fetta rimanente in verticale per rimuovere il sottocampo CA3 e subiculum. Tagliare un angolo della fetta per identificare la superficie superiore del tessuto.

NOTA: Nel caso di consegna virale di proteina di interesse è richiesta, la sezione intero tessuto può essere fissato dopo che il supporto viene rimosso con un delicato risciacquo di tampone ghiacciato. Questo è seguito da tagliare il CA1.

Passaggio critico: tenere traccia del lato superiore del tessuto in modo corretto per il sezionamento delle griglie in seguito.

3. Rimuovere accuratamente il tessuto dalla membrana utilizzando il retro del bisturi. Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire delicatamente il tessuto ad un 12-pozzetti contenente 0,1 M tampone fosfato.
4. Rimuovere il tampone nel pozzo dalla piastra e aggiungere 500 & mu; l - 1 ml di fissativo ghiacciato (pH 7,3) comprende il seguente: 0,1% acido picrico, 1% paraformaldeide e glutaraldeide 2,5% in tampone fosfato 0,1 M. Incubare per 2 ore a 4 ° C.

NOTA: L'acido picrico può essere esplosivo allo stato secco. Keep it bagnato con acqua in un contenitore ermeticamente chiuso. Conservare in luogo asciutto e ben ventilato.

5. Rimuovere il fissativo dal pozzo e lavare campioni 3 volte (20 minuti ciascuna) in tampone fosfato 0,1 M.
6. Incubare per 40 min in 1% acido tannico (w / v) in tampone maleato 0,1 M, pH 6,0.
7. Risciacquare due volte (20 minuti ciascuna) in tampone maleato.
8. Incubare per 40 min in acetato di uranile 1% (w / v) in tampone maleato al buio. Acetato di uranile è sensibile alla luce ed è radioattivo. Coprire il becher con Parafilm per soluzioni e memorizzare qualsiasi buffer utilizzato al buio a 4 ° C.
9. Risciacquare due volte (20 minuti ciascuna) in tampone maleato.
10. Incubare per 20 min a cloro platino 0,5%ide (w / v) in tampone maleato.
11. Risciacquare due volte (20 minuti ciascuna) in tampone maleato. Conservare i campioni a 4 ° C fino a quando non sono pronti per ulteriori elaborazioni.

2. Disidratazione e Embedding

Ossido di propilene è cancerogeno. Evitare i vapori lavorando con essa in una cappa aspirante. Utilizzare assoluto, etanolo puro al 100% che non contiene alcuna traccia di acqua. Diluire la etanolo assoluto per la produzione di diverse concentrazioni per la disidratazione.

Giorno 2

1. Incubare per 5 min in 50% etanolo e poi per 5 minuti in etanolo al 70%.
2. Incubare per 15 min in appena preparato 1% p-fenilendiammina (PPD) in etanolo al 70%.
3. Risciacquare tre volte in 70% di etanolo.
4. Incubare per 5 min in 80% etanolo e poi per 5 minuti in etanolo al 95%.
5. Incubare in etanolo al 100% due volte ogni 5 min.
6. Preparare fiale di vetro con tappo a vite e assicurarsi che siano puliti e completamente asciutti. Trasferimento fette di fiale di vetro eetichettare ogni flacone semplice e chiaro.
7. Incubare per 5 min in etanolo 01:01: ossido di propilene.
8. Incubare in ossido di propilene al 100% due volte ogni 5 min.
9. Aggiungi resina (Epon) ad ogni flacone di fare una miscela 1:1 con ossido di propilene. Mescolare delicatamente per 2 ore. Non agitare le fiale troppo rigorosamente per evitare bolle che potrebbero interferire con l'incorporamento.
10. Aggiungere resina per fare una miscela 3:1 con ossido di propilene, e mescolare per 2 h.
11. Trasferimento al 100% resina e incubare O / N.

Giorno 3

12. Campioni Sandwich tra strisce di plastica ACLAR e cura per 24 ore a 60 ° C.

3. Sezionamento e Montaggio su griglie

Giorno 4

1. Tagliare semi-sottili (0,5 micron) sezioni e macchia con l'1% blu di toluidina + 1% borace per determinare il corretto orientamento dei campioni.
2. Tagliare sezioni ultrasottili (60 nm) e montare sulle griglie di nichel, una sezione per ogni griglia.

4. Immunoistochimica

Tutti i tamponi e l'acqua deve essere filtrata prima dell'uso.

Giorno 5

1. Posizionare una goccia (~ 50 ml) di tampone Tween-20/phosphate 1% (T / PB), pH 7,5, su un pezzo di Parafilm pulito su una superficie piana. Delicatamente sollevare la griglia con pinza pulita dal bordo e galleggiare sul buffer, sezione giù, e incubare per 10 minuti a RT.
2. Drenare il liquido in eccesso dalla griglia mettendo fianco sezione sulla carta da filtro e poi galleggiare su 50 mM glicina in T / PB per 15 minuti a RT.

PUNTO CRITICO: per evitare 'riporto' eccessivo di soluzioni da una goccia soluzione all'altra durante le incubazioni, scolare il liquido in eccesso toccando delicatamente il bordo della griglia su # 1 carta da filtro tra ogni cambio di soluzione. Rimuovere anche la soluzione intrappolato tra le braccia della EM pinza che tiene la griglia delicatamente assorbente con una scheggia di carta da filtro tra le braccia, mentre pinze assicusuonare le sezioni non si asciughi completamente.

3. Asciugare la griglia con carta da filtro e poi galleggiano sul blocco soluzione contenente 2,5% di BSA e 2,5% di siero da animali dell'anticorpo secondario in T / PB per 30 minuti a RT.
4. Incubare con l'anticorpo primario (in T / PB) a RT o O / N a 4 ° C. Il tempo ottimale e la temperatura di incubazione, nonché la concentrazione di anticorpi, devono essere determinati sperimentalmente.
5. Lavare la griglia di tre volte (2 min ciascuno) con T / PB.
6. Incubare con anticorpo secondario (1:20 anti-coniglio o anti-topo accoppiata a 10 nm oro) per 1 ora a RT.
7. Lavare tre volte (2 min ciascuno) con T / PB.
8. Postfix con 2% di glutaraldeide in T / PB per 5 min.
9. Lavare tre volte (2 min ciascuno) con T / PB e poi tre volte (2 min ciascuno) con acqua filtrata.
10. Incubare con acetato di uranile 2% in acqua per 10 min.

Mentre la griglia è la colorazione, preparare un _2-free camera di CO mise enga pezzo di Parafilm nel centro di un piatto di vetro Petri. Quindi posizionare 4-6 pellet di NaOH nel piatto intorno Parafilm di assorbire CO _{2 nell'aria.} Mantenere alto chiuso per alcuni minuti. Utilizzare una pipetta Pasteur e trasferire rapidamente un piccolo volume di soluzione di citrato di piombo Reynold alla Parafilm nella capsula Petri di vetro. Aprire il top appena sufficiente inserire la pipetta Pasteur per minimizzare la reintroduzione di CO ₂ nella camera.

NOTA: Per la soluzione di piombo citrato di Reynold, far bollire 100 ml di acqua deionizzata in un forno a microonde e lasciate raffreddare in un contenitore ermetico. In un pallone da 50 ml con tappo, nitrato di piombo mix 1,33 g, 1,76 g di citrato di sodio e 30 ml di acqua bollita agitando vigorosamente per 1 min. Poi agitare intermittenza per 30 min. A questa soluzione nuvoloso, aggiungere 8 ml di idrossido di sodio 1 M e lentamente invertire il pallone un paio di volte. Soluzione sarà chiaro. Portare la soluzione a 50 ml con il wa bollitoter. Conservare la soluzione ermeticamente chiusi. Se precipitato, scartare e fare una nuova.

11. In tre bicchieri più piccoli preparare calda, acqua appena bollita deionizzata. Lavare l'acetato di uranile immergendo la griglia nel bicchiere prima e delicatamente roteare intorno per 30 sec. Ripetere questa operazione per le altre due bicchieri.
12. Aprire la parte superiore del piatto di vetro Petri basta per inserire la griglia sulla goccia di soluzione di citrato di piombo Reynold. Se possibile, indossare una maschera mentre si fa questo per evitare di inalare il citrato di piombo e per prevenire la formazione di precipitato. Incubare per 10 min.
13. Aprire il top basta per eliminare la griglia. Evitare di respirare il citrato di piombo. Lavare la griglia di tre volte, immergendolo in sequenza in tre bicchieri con acqua calda e bollente distillata. Lasciare asciugare la griglia su un pezzo di carta da filtro, la sezione. Il campione è pronto per il microscopio elettronico.

Risultati

La Figura 2B mostra un esempio di distribuzione di molecole endogene Ng in spine dendritiche dei neuroni dell'ippocampo CA1 piramidale. Griglie nichel con ultrasottili (60 nm) tessuti contenenti regione CA1 dell'ippocampo (come visto in Figura 2A) sono stati coperti in 1% T / PB, 50 mM glicina, poi bloccate con BSA 2,5% e 2,5% di siero prima dell'incubazione con anticorpi anti Ng-anticorpo. Dopo lavaggio con T / PB, griglie sono state poi coperto in anti-coniglio anticorpo secondario ac...

Discussione

In questo protocollo, abbiamo adottato il metodo Phend e Weinberg per il cervello e del midollo spinale per studiare spine dendritiche nelle culture fetta dell'ippocampo di ratto. Spine dendritiche in ippocampo CA3-CA1 zona sono strutture delicate che contengono una grande varietà di proteine ​​che svolgono un ruolo importante nel regolare le funzioni neuronali. Il metodo proposto fornisce un approccio equilibrato per raggiungere antigenicità maggiore pur mantenendo una buona conservazione ultrastrutturale (...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra di Petri in polistirene 60 x 15 mm	Falcon	351007
Bisturi monouso	EXELINT	29552
Inserti per colture cellulari	Millipore	PICM03050
10 nm Oro capra-anti-coniglio	Microscopia elettronica Scienze	25108
Anticorpo anti-neurogranina	Millipore	AB5620
100% Acido picrico	Microscopia elettronica Scienze	19550
96% Paraformaldeide	Acros Organics	AC41678-0030
25% Glutaraldeide (grado EM)	Sigma	G5882
Acetato di uranile	Microscopia elettronica Scienze	22400
p-Fenilendiammina	Sigma	P6001
Cloruro	di platino (IV)Sigma	379840
Acido tannico Microscopia	elettronica Scienze	21710