Articolo metodologico

Rivestimenti grafene per impianti biomedici

DOI:

10.3791/50276

1 marzo 2013

In questo articolo

Sommario

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Grafene offre potenziale come materiale di rivestimento per protesi biomedicali. In questo studio si dimostra un metodo per il rivestimento di leghe in nitinol con strati di grafene nanometri di spessore e di determinare il modo in grafene possono influenzare la risposta dell'impianto.

Abstract

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Grafene atomico liscio come un rivestimento di superficie ha il potenziale per migliorare le proprietà degli impianti. Questo viene illustrato un metodo per il rivestimento di leghe di nitinol con strati spessi nanometri di grafene per applicazioni come materiale stent. Grafene è stato coltivato su substrati di rame attraverso la deposizione di vapore chimico e quindi trasferita su substrati nitinol. Per comprendere come il rivestimento grafene potrebbe cambiare risposta biologica, vitalità cellulare delle cellule endoteliali aortiche ratto e topo cellule muscolari lisce aortiche stato studiato. Inoltre, l'effetto di grafene rivestimenti su adesione cellulare e la morfologia è stato esaminato con microscopia confocale a fluorescenza. Le cellule sono state colorate per actina e nuclei, e c'erano differenze notevoli tra incontaminate campioni nitinol rispetto al grafene rivestite campioni. Espressione di actina totale da ratto cellule muscolari lisce dell'aorta è stato trovato con Western Blot. Proteine ​​caratteristiche di adsorbimento, un indicatore per trombogenicità potenziale, were determinata per il fibrinogeno albumina sierica e con elettroforesi su gel. Inoltre, il trasferimento di carica dal fibrinogeno al substrato è stata dedotta mediante spettroscopia Raman. Si è constatato che il rivestimento grafene nitinol substrati soddisfatto i requisiti funzionali per un materiale stent e migliorato la risposta biologica rispetto a non patinata nitinol. Così, il grafene nitinol rivestito è un valido candidato per un materiale stent.

Introduzione

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Negli ultimi tre decenni hanno visto la scoperta di nuovi materiali a base di terapie e dispositivi per trattamenti di malattia e la diagnostica. Nuovi materiali in lega come nitinol (NiTi) e acciaio inox sono spesso utilizzati nella produzione di impianti biomedico per le loro superiori proprietà meccaniche. 1-3, tuttavia, numerose sfide ancora a causa della citotossicità materiale esogeno, bio-e emo-compatibilità. La natura metallica di questi risultati leghe in scarsa bio-e emocompatibilità causa di lisciviazione metallo, mancanza di adesione cellulare, proliferazione, e trombosi quando entra in contatto con il sangue che scorre (ad esempio cateteri, innesti vascolari, stent vascolari, valvole cardiache artificiali ecc.). 1, 4, 5 L'interazione di proteine ​​o cellule viventi con superficie dell'impianto può portare a una forte risposta immunologica e la conseguente cascata di reazioni biochimiche possono compromettere la funzionalità del dispositivo. Pertanto, è pertinENT per ottenere il controllo delle interazioni tra impianti biomedici e il suo ambiente circostante biologico. Modificazione superficiale è spesso impiegato per ridurre o prevenire la risposta fisiologica avversa proveniente dal materiale di impianto. Un rivestimento di superficie ideale dovrebbe avere alta resistenza di adesione, inerzia chimica, elevata scorrevolezza e buona emo-e biocompatibilità. Precedentemente, numerosi materiali compresi carbonio tipo diamante (DLC), SiC, TiN, TiO 2 e molti materiali polimerici sono stati testati come rivestimenti impianti biocompatibili superficie. 1, 6-23 Tuttavia, questi materiali sono ancora in grado di soddisfare tutte i criteri funzionali per un rivestimento adatto superficie dell'impianto.

La scoperta di strato atomo di spessore di carbonio sp 2, noto come grafene, ha aperto le porte per lo sviluppo di nuovi materiali multifunzionali. Il grafene è dovrebbe essere un candidato ideale per il rivestimento di superficie implantare in quantoè chimicamente inerte, atomicamente liscia e molto resistente. In questa lettera, si indaga la fattibilità di grafene come un rivestimento di superficie per gli impianti biomedici. I nostri studi dimostrano che il grafene nitinol rivestito (Gr-NiTi) soddisfa tutti i criteri funzionali, e supporta inoltre eccellente muscolatura liscia e la crescita delle cellule endoteliali che porta alla proliferazione cellulare meglio. Troviamo anche che il siero albumina adsorbimento su Gr-NiTi è superiore fibrinogeno. È importante sottolineare che, (i) le nostre misurazioni dettagliate spettroscopiche confermato la mancanza di trasferimento di carica tra il grafene e fibrinogeno suggerendo che il rivestimento di grafene inibisce l'attivazione piastrinica da parte di impianti, (ii) i rivestimenti di grafene non mostrano alcuna significativa tossicità in vitro per le linee endoteliali e muscolari lisce delle cellule che confermano loro biocompatibilità, e (iii) rivestimenti grafene sono chimicamente inerti, resistenti ed impermeabili in ambiente sangue scorre. Questi emo-e proprietà biocompatibili, con st altarength, inerzia chimica e resistenza, rendono rivestimenti grafene come rivestimento superficie ideale.

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Protocollo

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1. Grafene rivestimento di NiTi

  1. I campioni di grafene utilizzati in questo studio sono stati coltivati ​​in rame (Cu) substrati usando la tecnica di deposizione chimica di vapore, e successivamente trasferiti a 4,5 mm 2 substrati NiTi.
  2. Cu lamine (1 cm x 1 cm) sono stati posti in un forno tubolare 1 in quarzo e riscaldato a 1000 ° C in presenza di 50 sccm di H 2 e 450 sccm di Ar.
  3. Successivo, metano (1 e 4 sccm) è stato introdotto nel forno a portate diverse per 20-30 min. I campioni sono stati infine raffreddato a temperatura ambiente sotto flusso H 2, Ar e CH 4.
  4. Successivamente, le lamine Cu erano spin-rivestito con PMMA (diluito con 4% anisolo) a 4.000 giri seguita da un trattamento termico per 5 minuti a 150 ° C. Grafene attaccato al PMMA strato stata ottenuta incidendo il foglio Cu utilizzando Transene Inc., CE-100 mordenzante, e successivo risciacquo in HCl 10% e acqua deionizzata per 10 min.
  5. La samples stati trasferiti NiTi substrati (4,5 mm 2) e ricotto a 450 ° C in Ar (300 sccm) e H 2 (700 sccm) per 2 h per rimuovere il PMMA. Infine, i substrati sono stati lavati con acetone per sciogliere il residuo PMMA per ottenere il Gr-NiTi campione. Un reticolo monocromatore XY Dilor tripla stato utilizzato per la caratterizzazione micro-Raman (con obiettivo 100X) di tutti i GR-NiTisamples con l'eccitazione 514,5 nm da un laser a ioni Ar +.

2. Tossicità in vitro di Gr-NiTi

Cellule endoteliali aortiche Rat (cellulare applicazione Inc.) sono state coltivate in un gelatina rivestito 8 Far scorrere camere. Per testare la crescita cellulare, incontaminata e Gr-NiTisubstrates sono stati posti in pozzetti senza rivestimento di gelatina. Scansione di immagini di microscopia elettronica sono stati ottenuti usando un S-4800 Hitachi SEM. Inoltre, ratto cellule muscolari lisce aortiche sono stati coltivati ​​in Cellbind piastre a 96 pozzetti come gruppo di controllo (Corning) in Dulbecco Eagle modificato Medio (ATCC).

  1. Per testare la vitalità cellulare, cellule (cellule muscolari lisce ed endoteliali sia) sono state seminate a 10 5 cellule / pozzetto in pozzetti contenenti incontaminata NiTi, 1 sccm o 4 sccm Gr-NiTi substrati, dove il sccm indicato corrisponde al flusso di metano utilizzato nella crescita CVD di grafene. Le cellule sono state coltivate per il periodo di tempo desiderato in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2, scambiando supporti ogni altro giorno.
  2. Al punto di fine, mezzo è stato rimosso e mezzi freschi contenenti 0,5 mg / ml tiazolil blu tetrazolio bromuro (MTT o ottenuti da Sigma) è stato aggiunto a ciascun pozzetto. Le cellule sono state poi incubate per ulteriori 3 ore. Per il saggio MTS, mezzo è stato rimosso al punto finale di tempo e sostituito con 120 microlitri di soluzione MTS lavoro (Cell 96 Tier acquosa, Promega) e incubate per 3 ore.
  3. Successivo, supporti stato rimosso delicatamente e 100 ml di dimetilsolfossido (Sigma) è stato aggiunto a ciascun pozzetto. Dopo alloala 10 min per i cristalli MTT per sciogliere, la soluzione è stata trasferita ad un'altra piastra bene. Per il saggio MTS, non dimetilsolfossido è stato aggiunto ai pozzetti. Contenuto dei pozzetti sono stati spostati in una nuova piastra.
  4. Assorbanza è stata letta a 490 nm e la redditività percentuale è stata determinata normalizzando assorbanza alla assorbanza media del campione NiTi incontaminata. Almeno cinque ripetizioni erano fatte per ogni tipo di campione.

3. Studi microscopia confocale della morfologia cellulare

  1. Per confocale di ratto cellule muscolari lisce aortiche, substrati erano poste in una camera di scorrimento 8-(Thermo Scientific). Le cellule sono state seminate a 25.000 cellule / camera e incubate per 3 giorni a 37 ° C e 5% di CO 2.
  2. Cellule sono state fissate sul substrato con 4% di formaldeide in PBS per 20 min.
  3. Permeabilizzate con 0.1% Triton-X per 1 min.
  4. Actina è stato colorato con Alexa Fluor 488 falloidina (LifTecnologie e). 100 pl di alexafluor falloidina 488 a 200 unità / ml in metanolo è stata aggiunta a 1,9 ml di tampone fosfato. Le cellule sono state colorate con 250 microlitri di alexafluor 488 phalloidin per 45 min e poi lavate due volte con tampone fosfato.
  5. I nuclei sono stati montati con il mezzo Vectashield fluorescente di montaggio contenente DAPI (Vector Laboratories). Immagini confocali sono stati raccolti usando un Nikon confocale TI. Una camera seminati con cellule senza substrato è stato utilizzato come controllo.

4. Adsorbimento di proteine ​​Studi

  1. Dimensioni del substrato sono state misurate con pinze prima di iniziare gli esperimenti di proteine ​​di adsorbimento. Tre misurazioni sono state effettuate per ciascun lato dei campioni approssimativamente quadrata e mediati per ottenere la lunghezza e larghezza.
  2. Ogni campione, incontaminata NiTi, e 1sccm 4sccm Gr-NiTiwere incubate con 1 mg / ml di albumina in tampone fosfato salino (PBS) o 1 mg / ml in PBS fibrinogeno in camera temperatura per 3 ore.
  3. Alike campioni sono stati combinati in una provetta per microcentrifuga con 200 microlitri di tampone campione riduzione e bollito per 5 min.
  4. I campioni sono stati quindi diluiti in un tampone Tris / Glicina / SDS buffer (Bio-Rad) e passare per un 4-15% gel elettroforesi di poliacrilammide Tris (Bio-Rad) a 90 V per 100 min.
  5. I gel sono stati colorati con SYPRO Rosso. Diluire SYPRO Rosso (Life Technologies) soluzione madre a 1:5.000 in 7.5 v / v% di acido acetico. Macchia gel per 60 min.
  6. Immagine utilizzando un gel SP Flourchem (Alpha Innotech). Intensità fluorescente è stata quantificata utilizzando il software ImageJ. Intensità di fluorescenza per ciascun campione è stata normalizzata per la superficie totale di substrato e fibrinogeno adsorbimento è stato confrontato con albumina adsorbimento.

5. Western Blotting per l'espressione proteica

  1. Western blot è stata eseguita per analizzare actina totale nel ratto cellule muscolari lisce aortiche. Le cellule sono state seminate a 10.000 cellule / substrato in un 96-well piastra.
  2. Le cellule sono state coltivate per tre giorni prima di rimuovere i media. Proteina totale è stato estratto utilizzando tampone RIPA e uno standard saggio BCA (Lamda) è stata eseguita per quantificare proteine ​​totali.
  3. Campioni sono stati diluiti alla stessa concentrazione in RIPA e poi bolliti in un tampone riducente per 5 min.
  4. Proteine ​​sono state separate da un gel di poliacrilammide al 4-15% Tris tramite elettroforesi a 90 V per 100 min. Un caleidoscopio proteina standard (Bio-Rad) è stato utilizzato per valutare il peso molecolare della proteina.
  5. Le proteine ​​sono state trasferite su una membrana PVDF e bloccato con un 1% secco non grasso del latte (Bio-Rad) soluzione.
  6. Actina totale è stato etichettato con un anticorpo di coniglio anti-topo actina (Sigma). Un BM chemiluminescenza kit (Roche) è stato utilizzato per rilevare l'anticorpo primario. Le membrane sono state ripreso utilizzando FlourChem SP immagini attrezzature e intensità di fluorescenza è stata misurata utilizzando il software ImageJ. L'intensità della fluorescenza è stata normalizzata confrontando il pristine NiTisample.

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Risultati

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. Figura 1 a) grafene policristallino CVD coltivate su Cu lamine imita i grani di metallo di cristallo (barra di scala: 10 micron). b) spettro Raman di 1 sccm (4 sccm) mostra grafene monostrato banda che indica intensa (relativamente più debole) G '(strato pochi) la natura di come preparati grafene. c) immagine AFM di grafene trasferite sulle NiTi presenta una rugosità ~ 5 nm. Barra di scala = 500 n...

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Discussione

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Biocompatibilità e citotossicità: La deposizione chimica da fase vapore (CVD) metodo ha prodotto campioni policristallini grafene riproducenti grani di cristallo Cu, come illustrato in Figura 1A. Abbiamo utilizzato la spettroscopia Raman per confermare la presenza di monostrato (strato di pochi) di grafene su 1 sccm (4 sccm) campioni (cfr. figura 1b). Chiaramente, 1 sccm (4 sccm) campioni mostrano fascia indicativa di monostrato intenso (relativamente più debole) G '(strato...

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagente
Eagle modificato da Dulbecco Medio ATCC 30-2002
Tiazolil blu tetrazolio bromuro Sigma-Aldrich M2128
CellTiter 96 Una soluzione acquosa la proliferazione delle cellule del dosaggio (MTS) Promega G3582
Dimetilsolfossido Sigma-Aldrich D8418
36,5% di formaldeide Sigma-Aldrich F8775
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Alexafluor 488 falloidina Life Technologies A12379
Vectashield mezzo di montaggio con DAPIo Vector Laboratories H-1200
Albumina di siero umano Sigma-Aldrich A9511
Fibrinogeno umano
Tris / Glycine / SDS Bio-Rad 161-0732
Gel pronta Tris-HCl Gel Bio-Rad 161-1158
Acido acetico Sigma-Aldrich 45726
SYPRO Red Life Technologies S-6653
Proteine ​​BCA basso Lamda Biotech G1003
Precision Plus Kaleidoscope standard Protein Bio-Rad 161-0375
Immun-Blot PVDF membrane Bio-Rad 162-0177
Blotting grado bloccanti non-grassi del latte secco Bio-Rad 170-6404XTU
Anti-actina anticorpo prodotto in coniglio Sigma-Aldrich A2066
BM kit chemiluminescenza Western Blotting (topo / coniglio) Roche Applied Science 11520709001
Tampone RIPA Sigma-Aldrich R0278
NiTi (Ni 51%, 49% Ti) Alfa-Aesar 44953
Attrezzatura
Horiba JobinYvon Spettrometro Raman Dilor XY 98
Nikon Microscopio confocale Eclipse TI microscopio
Thermoscientific Lettore di piastre
Bio-Rad Alimentazione 164-5050 PowerPac alimentazione di base
Bio-Rad Elettroforesi cella 165-8004 Mini-PROTEAN tetra cella
Bio-Rad Gel portacassette 170-3931 Mini gel cassetta porta

Riferimenti

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