Il glicocalice endoteliale / endoteliale strato superficiale è perfettamente studiata usando la microscopia intravitale. Microscopia intravitale è tecnicamente difficile in un organo in movimento come il polmone. Si dimostra come brightfield simultanea e microscopia a fluorescenza possono essere utilizzate per stimare endoteliale spessore dello strato di superficie in un movimento liberamente In vivo Polmonare mouse.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Nella misura in vivo della superficie polmonare strato endoteliale mouse
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il glicocalice endoteliale è uno strato di proteoglicani e glicosaminoglicani associati rivestono il lume vascolare. In vivo, il glicocalice è altamente idratata, formando uno strato consistente superficie endoteliale (ESL) che contribuisce al mantenimento della funzione endoteliale. Come il glicocalice endoteliale è spesso aberrante in vitro e si perde durante tecniche standard di fissazione dei tessuti, studio della ESL richiede l'uso di microscopia intravitale. Per meglio approssimare la fisiologia complesso del microcircolo alveolare polmonare immagini intravitale è idealmente eseguita su un polmone liberamente mobile. Tali preparazioni, tuttavia, tipicamente soffrono di artefatti da movimento ampio. Si dimostra come chiuso petto microscopia intravitale di un polmone topo liberamente mobile può essere utilizzato per misurare l'integrità glicocalice con esclusione ESL di fluorescenza destrani marcati ad alto peso molecolare dalla superficie endoteliale. Il mancato recupero tecnica chirurgica, che richiedebrightfield simultanea e imaging fluorescente del polmone mouse, consente l'osservazione longitudinale del microcircolo subpleurica senza evidenza di indurre lesioni confondimento polmonare.
Introduzione
Il glicocalice endoteliale è uno strato extracellulare di proteoglicani e glicosaminoglicani associati costeggiano il vascolare intimale. In vivo, il glicocalice è altamente idratata, formando uno strato consistente superficie endoteliale (ESL) che regola una varietà di funzioni endoteliali compreso permeabilità di un fluido 1, neutrofili-endoteliale adesione 2, e l'meccanotrasduzione di fluido 3 shear stress.
Storicamente, il glicocalice è stata sottovalutata a causa della sua aberrance in preparazioni di cellule in coltura 4, 5 e la sua degradazione durante il fissaggio del tessut....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Preparazione dei tubi chirurgici, cateteri vascolari, Muro Finestra Busto
- Fase di microscopia intravitale. Abbiamo misura una fase in plexiglass su cui si trova il mouse anestetizzato durante la microscopia. Questo stadio ospita sia di 15 cm per 10 scheda di plastica flessibile di taglio cm (su cui il mouse si trova durante l'induzione dell'anestesia, il posizionamento tracheostomia, e cateterismo venoso), così come un elemento riscaldante di dimensioni analoghe (che si trova sotto il tagliere).
- Mouse toracostomia preparazione tubo (Figura 1). A 10 cm di lunghezza del tubo PE 50 (Intramedic, diametro i....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
L'approccio sperimentale descritto in fasi 1-6 consentirà cattura di fotogrammi di DIC simultanea (campo chiaro) e immagini fluorescenti. Per determinare lo spessore ESL, le immagini registrate vengono esaminati da un osservatore cieco dopo il completamento del protocollo sperimentale. Utilizzando un telaio a fuoco, subpleurica microvasi (<20 micron di diametro) sono identificati; almeno 3 microvasi trovano tipicamente in un unico telaio (Figura 10). Utilizzando software di analisi di immagine (N.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Coincidente con il diffondersi di microscopia in vivo, vi è crescente apprezzamento sia per la notevole entità delle ESL così come i suoi numerosi contributi alla funzione vascolare. Questi dati emergenti, tuttavia, derivano principalmente da studi del sistema vascolare sistemica. In effetti, l'uso di microscopia in vivo nel polmone è tecnicamente impegnativo, dato artefatto significativo movimento polmonare e cardiaca.
Diversi recenti progressi tecnici hanno consentito.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo Drs. Arata Tabuchi e Wolfgang Kuebler (Università di Toronto) per l'istruzione per quanto riguarda la microscopia intravitale. Ringraziamo Andrew Cahill (Nikon Instruments) per l'assistenza nella progettazione e realizzazione di microscopia. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH / NHLBI concede P30 HL101295 e K08 HL105538 (per EPS).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | |||
| FITC-destrano (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-destrano (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidina rivestite microsfere fluorescenti | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Drago Verde fluorescenza (simile a FITC) |
| Ketamina | Moore Medical | ||
| Xylazina | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinilato | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | Diluizione 1:50 |
| Isotipo anticorpo biotinilato | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | Diluizione 1:50 |
| ATTREZZATURE | |||
| Ventilatore meccanico | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomia catetere | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Apparecchi Elettrocauterizzazione | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Cauterizzazione bipolare pinza | Olsen Medical | 10-1200i | 9,9 centimetri McPherson |
| Temperatura Control Sistema | Mondo Strumenti di precisione | ATC1000 | |
| Pompa a siringa | Harvard Apparatus | Pompa 11 Elite | |
| Microscopio (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscopio (confocale) | Nikon | A1R | |
| Image Splitter | Fotometrici | DV2 | |
| Telecamera CCD | Fotometrici | CoolSNAP HQ2 | |
| Immagine software di elaborazione | Nikon | NIS Elements | |
| Membrana di polivinilidene | Kure Wrap | ||
| Fodera circolare | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, uno spessore # |
| Colla (fodera a membrana) | Pattex | Flüssig (liquido) | Per l'apposizione vetrino alla membrana |
| Colla (coperchio a scorrimento del mouse) | Pattex | Gel | Per il fissaggio della membrana per il mouse |
| Tubo chirurgico | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suturare | Pescatore | Seta 04:00 | |
| Rasoio elettrico | Oster | 78997 | |
| Curve pinze chirurgiche | Roboz | ||
| Dritti pinza chirurgica | Roboz | ||
| Forbici chirurgiche | Roboz | ||
| Microforbici chirurgici | Roboz | ||
| Ago chirurgico conducente | Roboz | ||
| Nastro chirurgico | Pescatore | ||
| Spugne da cucina (tagliati a spicchi) | vario |
Riferimenti
- Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung. AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).
- Schmidt, E. P., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
