Articolo metodologico

Indagine di polarizzazione dei macrofagi Utilizzando Bone Marrow macrofagi derivati

DOI:

10.3791/50323

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23 giugno 2013

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1Department of Animal Science, Texas A&M University, 2Department of Biology, Texas A&M University, 3Department of Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University

In questo articolo

Sommario

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L'articolo descrive un semplice facilmente adattabile In vitro Modello per studiare la polarizzazione dei macrofagi. In presenza di GM-CSF/M-CSF, cellule staminali / progenitrici ematopoietiche del midollo osseo sono dirette nella differenziazione monocitica, seguita dall'attivazione M1 o M2. Lo stato di attivazione può essere seguita da cambiamenti antigeni di superficie cellulare, espressione genica e le vie di segnalazione cellulare.

Abstract

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L'articolo descrive un adattamento prontamente semplice modello in vitro per studiare la polarizzazione dei macrofagi. In presenza di GM-CSF/M-CSF, cellule staminali / progenitrici ematopoietiche del midollo osseo sono dirette nella differenziazione monocitica, seguita dall'attivazione M1 o M2. Lo stato di attivazione può essere seguita da cambiamenti antigeni di superficie cellulare, espressione genica e le vie di segnalazione cellulare.

Introduzione

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Distinto da risposte infiammatorie classiche, macrofagi che infiltrano i tessuti spesso mostrano lo stato di attivazione polarizzato che gioca un ruolo cruciale nella regolazione delle funzioni fisiologiche del tessuto ospite 1-8. Dopo la stimolazione, l'attivazione dei macrofagi possono essere ordinati in classic (M1) e alternativi (M2) attivazione 2, 4, 9. Attivazione dei macrofagi M1 dipende da recettori Toll-like (TLR) e l'attivazione del fattore nucleare kappa B (NFκB) / c-Jun N-terminal chinasi 1 (JNK1), che porta alla produzione di citochine infiammatorie, come TNF-α e IL- 1β e l'attivazione di iNOS che si traduce in un aumento della produzione di specie reattive come ossido di nitruro (NO) 10, 11. In contrasto, M2 macrofagi attivazione reclute PPARy, PPARδ, o IL-4-STAT6 percorsi, portando a antinfiammatorio attivazione alternativa, (M2) che è associato con sovraregolazione di mannosio recettore CD206, e arginasi 1 (Arg1) 6, 12 - 14 </ Sup>.

Midollo osseo macrofagi derivati ​​(BMDM) presentano un ideale modello in vitro per capire i meccanismi che controllano la polarizzazione dei macrofagi attivati ​​15. Specificamente, l'attivazione dei macrofagi M1 può essere indotta da lipopolisaccaridi (LPS) stimolazione, mentre la polarizzazione dei macrofagi M2 può essere indotta da IL-4 e / o IL-13. Mature del midollo osseo macrofagi derivati ​​e macrofagi attivati ​​possono essere identificati attraverso l'analisi di citometria a flusso per l'espressione di antigeni di superficie, tra cui CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 e CD86 9, 16, 17. Inoltre, i cambiamenti nella produzione di citochine e di vie di segnalazione cellulari connessi con polarizzazione dei macrofagi possono essere misurati mediante RT-PCR e western blotting, rispettivamente. In sintesi, il midollo osseo del topo macrofagi derivati ​​possono servire da modello rilevante per studiare polarizzazione dei macrofagi in vitro.

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Protocollo

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1. Isolamento di cellule del midollo osseo

  1. Isolare femore e tibia ossa di 6-8 settimane di età i topi, risciacquare i capelli e poi tagliare aprire l'osso.
  2. Utilizzare un ago 21G e siringa da 10 ml per scovare midollo in PBS freddo +2% inattivato con il calore siero bovino fetale (FBS) (3-5 ml / mouse).
  3. Passare osseo attraverso un ago 21G 4-6 volte dissociare le cellule.
  4. Passate le cellule attraverso un colino cellula 70 micron per rimuovere grumi di cellule, ossa, capelli e altre cellule / tessuti.
  5. Aggiungere 3 volumi di soluzione di NH 4 Cl (0,8% soluzione di NH 4 Cl, Stemcell Technology), e incubare in ghiaccio per 10 minuti per rimuovere le cellule rosse del sangue.
  6. Centrifugare le cellule a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C.
  7. Risospendere il pellet di cellule in PBS freddo +2% FBS (20-50 ml, a seconda della quantità di cellule).

2. Induzione BMDM Formazione

  1. Risospendere le isolate cellule del midollo osseo in BMDM mezzo di crescita (2x10 6 cellule / ml).

Crescita BMDM media:

Piano di Iscove Modified Dulbecco (IMDM) + 10% FBS + 15% filtrata (0,2 micron) L-929 cellule (ATCC CCL-1) sovranatante di coltura (contenente monocito fattore stimolante le colonie, M-CSF) o 10 ng / ml M -CSF.

Nota: L-929 surnatante cella contiene M-CSF 18. Per garantire l'attività effettiva di mezzo condizionato, 5 x 10 5 L-929 cellule sono seminate in fiasche T75 cm 2 per 6-7 giorni, mezzo condizionato viene raccolta e fatta passare attraverso un filtro 0,45 micron prima dell'uso. Aliquote medie possono essere utilizzate immediatamente o conservate in -80 ° C per 1-2 mesi.

  1. Cellule di semi in 6 o 12 piastre di coltura di tessuti e (a seconda del disegno sperimentale) (Corning Costar).
  2. Cambiare BMDM fresco mezzo di crescita al giorno 3.
  3. Il giorno 7, la formazione di BMDM maturo viene valutata utilizzando l'analisi di citometria a flussoe fluoroforo anticorpi coniugati per rilevare le cellule che esprimono CD11b e F4/80.

3. BMDM attivazione Polarized

  1. Il giorno 7, cambiare per mezzo di stimolazione fresco: per l'attivazione M1, utilizzare IMDM contenente 10% FBS e 100 ng / ml di LPS o 100 ng / ml LPS con 50 ng / ml di IFN-y, per l'attivazione M2, usare IMDM contenente 10% FBS con 10 ng / ml di IL-4 e / o 10 ng / ml di IL-13.
  2. Collect BMDMs stimolati da staccandoli dal piatto caldo utilizzando 0,05% tripsina, seguita da lavaggio le cellule due volte con PBS contenente 10% FBS.

Nota: Per staccare e sospendere nuovamente macrofagi maturi dopo la differenziazione, soluzione di tripsina 0,05% (contenente 0,48 mM EDTA, Invitrogen) o 2-5 mm a Ca-Mg e priva di PBS o tampone bilanciata di Hank (HBSS) EDTA può essere utilizzato. Quando si utilizza medie digestivo contenente tripsina, le cellule vengono trattate a 37 ° C per meno di 10 min per evitare la perdita di surProteine ​​faccia a causa di sovra-digestione.

  1. Usare gli anticorpi per rilevare l'espressione di antigeni di superficie, tra cui CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 o CD86 in vari momenti che utilizzano procedure di colorazione di citometria a flusso standard.
  2. Determinare l'espressione di geni caratteristici di macrofagi M1 e M2 attivati ​​compreso IL-1β, TNF-α e IL-6 (attivazione M1) o IL-10, IL-13, arginase1 e PPAR (attivazione M2) mediante RT-PCR quantitativa. Determinare l'attivazione delle vie di segnalazione cellulare coinvolti nella attivazione dei macrofagi M1 o M2 da western blotting.

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Risultati

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Una descrizione schematica del procedimento BMDM generazione è presentato (Figura 1). Elevata purezza dei macrofagi maturi può osservare il giorno 7, quando rappresentano il 95 al 99% di CD11b + F4/80 + cellule (Figura 2). Macrofagi polarizzati possono essere esaminati utilizzando anticorpi contro CD11b, F4/80, CD11c e CD206 seguiti da analisi di citometria a flusso. Come mostrato in figura 3, i macrofagi M1 vengono rilevati come CD11b + F4/80 + CD11c + CD206-cellule (2...

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Discussione

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Riportiamo qui una procedura semplice e facilmente adattabile in vitro per indurre attivazione dei macrofagi derivati ​​da midollo osseo cellule progenitrici. Questa procedura può essere utilizzata per le indagini di meccanismi responsabili per la polarizzazione dei macrofagi. La purezza dei macrofagi maturi ottenuti usando questo protocollo medie 95-99%, e non necessita di ulteriori procedure di purificazione. Per studiare la funzione dei geni specifici di interesse nel contesto di polarizzazione macrofagica, ...

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla American Heart Association (BGIA 7.850.037 al dottor Beiyan Zhou).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
IMDMThermo ScientificSH30259.01
Siero fetale bovinoInvitrogen10438-026
Murine GM-CSFPeproTech315-03
NH4ClStemCell Technologies7850
L-929ATCCCCL-1
70 μ filtro cellulare mBD Biosciences352350
10 x PBSThermo ScientificAP-9009-10
Anti-topo CD11b-APCeBioscience17-0112-81
Anti-topo F4/80-FITCeBioscience11-4801-81
Anti-topo CD69-PEeBioscience12-0691-81
Anti-topo CD86-PEeBioscience12-0862-81
Iodio PropidioInvitrogenP3566

Riferimenti

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