Qui riportiamo una tecnica sperimentale di fluorescenza microscopia intravitale di visualizzare eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni sul endotelio attivato durante l'infiammazione vascolare e la formazione di trombi nei topi vivi. Questa tecnologia microscopica sarà prezioso per studiare il meccanismo molecolare della malattia vascolare e per testare agenti farmacologici in condizioni fisiopatologiche.
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Articolo metodologico
In tempo reale di immagine degli eterotipica piastrine-neutrofili interazioni sull'endotelio Attivato durante l'infiammazione vascolare e la formazione di trombi in topi vivi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Interazione delle piastrine attivate e leucociti neutrofili (principalmente) sulla trombosi attivato media endotelio e infiammazione vascolare. 1,2 Durante la formazione del trombo nel sito di lesione arteriolare, piastrine aderenti all'endotelio attivato e proteine della matrice subendoteliali supportare rotolamento dei neutrofili e adesione. 3 Viceversa, in venulare condizioni infiammatorie, aderenti neutrofili all'endotelio attivato può sostenere l'adesione e l'accumulo di piastrine circolanti. Eterotipica piastrine-neutrofili aggregazione richiede processi sequenziali dagli specifici recettori-counter interazioni tra cellule recettore. 4 È noto che cellule endoteliali attivate rilasciare molecole di adesione come fattore di von Willebrand, avviando adesione piastrinica e accumulo condizioni di alto shear. 5 Inoltre, cellule endoteliali attivate supportare rotolamento dei neutrofili e adesione da selectine esprimono unmolecola-1 di adesione intercellulare d (ICAM-1), rispettivamente, in condizioni di basso attrito. 4 piastrine P-selectina interagisce con neutrofili attraverso P-selectina glicoproteina ligando-1 (PSGL-1), inducendo così l'attivazione dei neutrofili β2 integrine e azienda adesione tra due tipi di cellule. Nonostante i progressi in esperimenti in vitro in cui sono determinati eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni in sangue intero o cellule isolate, 6,7 quegli studi non può manipolare durante condizioni di stress ossidativo malattia vascolare. In questo rapporto, con marcati in fluorescenza, anticorpi specifici contro un mouse piastrinica e dei neutrofili marcatore, si descrive un dettagliato protocollo intravitale microscopica per monitorare le interazioni eterotipiche di piastrine e dei neutrofili sul endotelio attivato durante il TNF-α indotta da infiammazione o dopo laser-indotta lesioni in Cremaster microvasi muscolari di topi vivi.
Protocollo
1. Preparazione di Microscopio intravitale (Figura 1A)
- Preparare tampone superfusione (125 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, e 17 mM NaHCO 3, pH 7,4).
- Attivare un bagnomaria circolatorio per mantenere la temperatura del tampone e termo-controllata coperta a 37 ° C. Aerare tampone con gas di azoto (5% di CO2 equilibrato con azoto).
- Accendere il sistema di microscopio (Sutter Lambda DG-4 ad alta velocità di lunghezza d'onda cambia, postazione computer, microscopio Olympus BX61W, MPC-200 multi-manipolatore, ROE-200 fase, macchina fotografica ad alta velocità, e intensificatore)....
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Risultati
Con un'analisi dettagliata microscopia intravitale, eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni sul endotelio attivato sono state visualizzate mediante infusione di anticorpi marcati con fluorescenza contro una piastrina (CD42c) o neutrofili marcatore (Gr-1) in topi vivi.
In un modello di TNF-α indotta infiammazione venulare, neutrofili più laminazione sono stabilmente aderito all'endotelio presumibilmente dall'interazione attivati β2 integrine con ICAM-1 durante il periodo d.......
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Discussione
Qui si descrive un protocollo dettagliato per tempo reale microscopia a fluorescenza intravitale di visualizzare eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni sull'endotelio vascolare attivato durante l'infiammazione e trombosi. In precedenza, simili approcci fluorescenza microscopiche sono stati segnalati per studiare il meccanismo molecolare della formazione di trombi e infiammazione vascolare. 8,12 Poiché il heterotypic interazione cellula-cellula potrebbe essere importante per vaso-occlusione al l.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano alcun interesse finanziario concorrente.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dal National Institutes of Health (P30 HL101302 e RO1 HL109439 a JC) e dell'American Heart Association (SDG 5.270.005 a JC). A. Barazia è stato sostenuto da una borsa di formazione T32HL007829 NIH.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | 144-55-8 | |
| 0,9% NaCl soluzione salina | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Ketamina | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xilazina | Lloyd | ||
| Tubi intramedicali (PE 90) | BD Diagnostics | 427421 | |
| Tubi intramedicali (PE 10) | BD Diagnostics | 427401 | |
| Murine TNF-α | R& D Systems | 410-MT | |
| Dylight 488- marcato ratto anti-topo CD42b anticorpo | Emfret Analytics | X488 | |
| Alexa Fluor 647-coniugato anti-topo Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Anticorpo | BioLegend | 108418 | |
| NESLAB EX bagnomaria/circolatore | Microscopio Thermo-Scientific | ||
| Olympus BX61W | Olympus | ||
| TH4-100 Power | Olympus | ||
| Lambda DG-4 | Sutter | ||
| MPC-200 multi-manipolatore | Sutter | ||
| R–-200 controller di scena | Sutter | ||
| C9300 telecamera ad alta velocità | Hamamatsu | ||
| intensificatore | Video scope Laser di | ||
| Strumenti fotonici, Inc. | |||
| l'imaging intelligente | SlideBook 5.0 |
Riferimenti
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Nieswandt, B., Kleinschnitz, C., Stoll, G. Ischaemic stroke: a thrombo-inflammatory disease. J. Physiol. 589, 4115-4123 (2011).
- Yang, J., Furie, B. C., Furie, B.
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Ristampe e permessi
