Assemblea dei nucleosomal matrici da ricombinanti core istoni e nucleosomi posizionamento DNA

Sommario

Un metodo viene presentato per la ricostituzione del modello nucleosomal array di istoni fondamentali ricombinanti e tandem ripetute di DNA posizionamento dei nucleosomi. Abbiamo anche descrivono come gli esperimenti di velocità di sedimentazione nel ultracentrifuga analitica e microscopia a forza atomica (AFM) vengono utilizzati per monitorare il grado di saturazione matrice nucleosomal dopo la ricostituzione.

Abstract

Octamers istoni core che sono ripetitivamente distanziati lungo una molecola di DNA sono chiamati matrici nucleosomal. Array nucleosomi sono ottenuti in uno dei due modi: la purificazione da fonti in vivo, o la ricostituzione in vitro da istoni fondamentali ricombinanti e tandem ripetute di DNA posizionamento dei nucleosomi. Il secondo metodo ha il vantaggio di consentire il montaggio di una più uniforme composizionale e matrice nucleosomal posizionamento preciso. Esperimenti velocità di sedimentazione del ultracentrifuga informazioni resa analitica circa le dimensioni e la forma delle macromolecole analizzando il tasso al quale migrano attraverso la soluzione sotto la forza centrifuga. Questa tecnica, insieme con microscopia a forza atomica, può essere utilizzato per il controllo di qualità, garantendo che la maggioranza dei modelli di DNA sono saturi di nucleosomi dopo ricostituzione. Qui si descrivono i protocolli necessari per ricostituire quantità milligrammo di lunghezza e compositivamente darray nucleosomal efined adatte per gli studi biochimici e biofisici della struttura e funzione della cromatina.

Introduzione

Genomi eucariotici non esistono DNA nudo, ma piuttosto vengono compattati e organizzati da proteine ​​legate. Questi complessi di DNA e proteine ​​sono noti come cromatina. L'unità di ripetizione di base della cromatina è il nucleosoma. Un nucleosoma è costituito da istoni ottamero e 146 paia di basi di DNA avvolto intorno al istoni ottamero circa 1,6 volte ^1. Il ottamero istone è composto di due copie ciascuna delle istoni H2A nucleo, H2B, H3, e H4. Octamers istoni core che sono ripetitivamente distanziati lungo una molecola di DNA sono chiamati matrici nucleosomal. La struttura ampliata di matrici nucleosomal è stato definito come la fibra 10 nm o le....

Protocollo

1. Assemblea dei ricombinanti fondamentali istoni in octamers

Motivazione: Il primo passo per nucleosomal matrice ricostituzione è quello di preparare native di base dell'istone octamers da liofilizzati istoni fondamentali ricombinanti. Istoni sono combinati in quantità molari uguali e assemblati in octamers istoni dai dialisi i campioni di un buffer di denaturazione in ripiegamento buffer.

1. Purificare e liofilizzare istoni fondamentali ricombinanti (H2A, H2B, H3, H4), come descritto ^13.
2. Sciogliere circa 5 mg di ciascun nucleo istone liofilizzato in 3 ml di tampone di dispiegamento (6 M guanidina HCl, 20....

Risultati

Per illustrare il protocollo abbiamo ricostituito array nucleosomal da ricombinanti istoni fondamentali Xenopus e DNA, rappresentati da 12 ripetizioni tandem 207 bp della sequenza di posizionamento 601 (601 ²⁰⁷ x 12). In primo luogo abbiamo assemblato octamers autoctoni istoni fondamentali liofilizzati e poi purificato il octamers da FPLC utilizzando una colonna S200 (Figura 1A). Complessi più grandi eluiscono prima dalla colonna S200. Istoni generalmente eluiscano in questo ordine: .......

Discussione

Nucleosomal array modello sono uno strumento molto utile per lo studio in vitro della struttura e funzione della cromatina. Ad esempio, sono stati ampiamente utilizzati per studiare il meccanismo di fibra condensazione della cromatina in soluzione ^30-34, e reso possibile ottenere una struttura a raggi X di un Tetranucleosome ^35. Più di recente si sono dimostrate utili a decifrare gli effetti strutturali delle varianti specifiche dell'istone nucleo, mutanti e modificazioni ^{post-14-.......}

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
(3-amminopropil)trietossisilano	Sigma-Aldrich	A3648-100ML
6-8 kDa MWCO Tubo per dialisi	Fisher	21-152-5
HiLoad Superdex 200 16/60 Colonna	GE	17-1069-01
Vivaspin 50 kDa MWCO Concentratore centrifugo	Sartorius	VS2031
12-14 kDa MWCO Tubo per dialisi	Fisher	08-667A
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine	GE	17-0476-01
XL-A/I Ultracentrifuga analitica	Beckman-Coulter