このプロトコルは、真菌昆虫病原物質を導入するには、2つの接種方法を示しています<em>ボーベリア</em>インゲンマメにおけるエンドファイトとして(<em>インゲンマメ</em>)、内部寄生生物的防除のその後の評価のための準備インチ
ボーベリアは endophytically植物にコロニーを形成する能力を持つ菌の昆虫病原物質である。エンドファイト、Bとバッシアナは草食や病気から植物を保護する役割を果たしている可能性がある。このプロトコルは、Bを確立する2つの接種方法を示しています内部寄生生物的防除のその後の評価の準備のために一般的な豆( インゲンマメ )でendophytically バッシアナ 。植物は、Bを受信する前に、2週間の表面殺菌した種子から栽培されている10 8分生子/ ml(または水)のボーベリア治療は 、葉面散布や土壌潅注のいずれかとして適用された。二週間後、植物を採取し、それらの葉、茎、根は内生菌類のコロニー形成を評価するためにサンプリングされます。このために、サンプルを個別に、滅菌した面である複数のセクションにカットし、20日間ポテトデキストロース寒天培地中でインキュベートした。メディアは次のように真菌の増殖を観察するために2〜3日ごとに検査されプラントセクションとレコード Bの発生とsociated バッシアナそのエンドファイトの植民地化の程度を推定する。接種の成功の分析は 、Bの発生を比較するトリートメントやコントロール間で与えられた植物の部分の中でバッシアナ ( すなわち 、葉、茎または根)。接種方法に加えて、実験の具体的な成果が目標作物種または品種に依存することがあり、真菌種は、昆虫病原物質株または使用切り分け、植物の生育条件。
真菌entomopathogensはmycopesticides 1とかなりの可能性を秘めた昆虫集団の重要な調節因子である。ごく最近になって、しかし、真菌entomopathogensは両方の自然と様々な接種方法2に応答して、エンドファイトとして発生することが示されている。内部寄生菌類entomopathogensの生態学的機能の大部分は不明のままですが、いくつかの研究では、植物の成長3,4、草食性5-8、および病害抵抗9,10でそれらが示唆されている。ここで紹介する方法の全体的な目的は、内部寄生生物的防除のその後の評価の準備のために、エンドファイトとして菌類昆虫病原物質を導入することである。
ボーベリア (バルサモ)Vullemin(子嚢菌門:ボタンタケ)が最も研究内生菌の昆虫病原物質5-9,11-19であり、そしてそれは商業mycopesticideとして利用可能です。接種方法を確立するためにテスト<eメートル> Bエンドファイトとしてボーベリア土壌の水薬14,17、種子コーティング18および浸漬14、幼根ドレッシング13,15、根および根茎はめ込み11,16,18、幹注射17、葉面スプレー14,17,20と花スプレー19を含む。これらのメソッドを使用して、研究者はBを導入していますバナナ11にバッシアナ 、豆7、カカオ13、コーヒー17、コーン7、綿7、ナツメヤシ12、ジュート21ケシ20、カボチャ7、ラジアータ松18、モロコシ14、トマト7、小麦7。最近の証拠は、その内生Bを示唆しているバッシアナだけではなく、節足動物害虫5-7,22-27から植物を保護するために可能性を秘めているだけでなく、いくつかの植物病原体9から。
インゲンマメ( インゲンマメ )害虫の影響を最も受けやすい作物間のランクと疾患。それは、その攻撃の領域28を越え、最も制限的な豆生産要素であると考えられている400以上の害虫や病原体200によって影響を受けることができます。したがって、共通のBeanがBで内部寄生生物的防除の完全なスペクトルを調べるために優れたモデル作物かもしれませんバッシアナ 。この方向での最初のステップとして、この記事では、インゲンマメにおけるエンドファイトとしてB.bassianaを導入するために接種方法として葉面スプレーや土壌の水薬を説明しています。
多くの要因がエンドファイトのような真菌昆虫病原物質を確立するための実験の特定の結果に影響を与えることができる。我々の結果は、接種方法は、そのうちの一つであることを示している。を使って実験する生物学的要因は、作物の種や品種を選択し、真菌種昆虫病原物質の歪みを含めたり、隔離するために使用。操作に考慮すべきその他の要因としては、接種物の濃度、接種時の植物の年齢、および植物の生育条件が含まれています。
それは、真菌昆虫病原物質14,17,18,21によって全身植物植民地化の結果に接種方法のために理想的であろう。代わりに、それは、接種方法は、ローカルの植民地化の特定のパターンを好む傾向があるように思われる。土壌水薬がルート植民17を好むのに対し、コーヒーでは、例えば、葉面スプレーは葉の植民地化を支持している。我々は、共通のBeanで同じパターンを発見した。最終的には、接種方法の選択は、あるべきおそらくターゲット草食動物や植物病原体のニッチをマッチング、工場内のエンドファイトの意図された場所に導かれ。
一般的に使用されていますが、メディア文化に基づいたエンドファイト検出および定量は、高価難しく、エラーが発生しやすくなります。たとえば、10800植物切片(1800ペトリ皿上にプレート)の合計は、Bを最適化するために、実験で評価したバナナ16でバッシアナ接種 。これらのうち、4496セクションは推定Bによって植民地化されたとして主にコロニー形態によって識別バッシアナ 、。明らかに、各コロニーのための樹種の微視的検証が望ましいのですが手が届かない段階だっただろう。一方、1176セクションは他の菌類によって植民地化され、破棄され、データ16を行方不明として扱われていました。確率はそのB.しかし、存在バッシアナが悪い選手や成長することが遅かったし、最終的にそれらのセクションから浮上している可能性がある場合十分な時間をllowed。したがって、メディア文化に基づいたエンドファイトの検出方法としては、偽陽性と偽陰性の対象となります。従って、例えば、より信頼性の高い検出および定量方法の開発は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイ20,21,24に基づくものは、十分に正当化される。
接種実験のための究極の目標は、草食性および/または疾患に対して耐久性のある全身の抵抗を提供する効率的な治療法を開発することであるべきです。もっともらしいが、まだテストされていない、仮説は、エンドファイトの植民地化の程度は、エンドファイト媒介抵抗の程度と正の相関であるということです。接種方法を精緻化した後自然な次のステップは、そのため、この相関関係を調べることである可能性があります。いくつかのビデオプロトコルは、研究者が標的害虫や病原体29から31に適した抵抗性検定を設計するのを助けることができます。最終的には、接種の成功を決定する何このアッセイであるる方法、および内部寄生生物的防除のために関連する潜在的な。
The authors have nothing to disclose.
生産と実験的な作品は、本明細書でレイナルドパレハの献身的で熱心な助けを反映提示。科学技術革新のコロンビアの管理部門(Colciencias)により、グランドチャレンジレーションズ·イニシアチブを通じてビル&メリンダ·ゲイツ財団からの助成金によって賄われて。
REAGENTS | |||
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
Mycotrol SE | Laverlam | 4167 | |
Noble agar | Sigma | A5431-250G | |
Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-25MU | |
Petri dish (100 x 15 mm) | Fisher | 08-757-12 | |
Petri dish (60 x 15 mm) | Fisher | 08-757-13A | |
Potato dextrose agar | Difco | 213400 | |
Regular bleach (NaOCl) | CLOROX | N/A | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
Tetracycline | Sigma | T3258-25G | |
Triple quince (NPK) | ABOCOL | N/A | |
Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
EQUIPMENT | |||
Biological safety cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
Leica DM LB microscope | Leica | N/A |