Dieses Protokoll zeigt zwei Impfung Methoden, um den Pilz Entomoerreger einzuführen<em> Beauveria bassiana</em> Als Endophyten in der gemeinsamen Bohne (<em> Phaseolus vulgaris</em>), In Vorbereitung für nachfolgende Auswertungen der endophytische biologischen Kontrolle.
Beauveria bassiana eine Pilz Entomoerreger mit der Fähigkeit zu Pflanzen endophytisch kolonisieren. Als Endophyt, B. bassiana eine Rolle beim Schutz der Pflanzen vor Insektenfraß und Krankheit spielen. Dieses Protokoll zeigt zwei Impfung Methoden B. etablieren bassiana endophytisch in der gemeinen Bohne (Phaseolus vulgaris), in Vorbereitung für spätere Auswertungen endophytischer biologische Kontrolle. Die Pflanzen werden von der Oberfläche sterilisiert Samen für zwei Wochen, bevor er eine B. gewachsen bassiana Behandlung von 10 8 Sporen / ml (oder Wasser) angewendet entweder als Blattspray oder eines Bodens durchnässen. Zwei Wochen später werden die Pflanzen geerntet und ihre Blätter, Stängel und Wurzeln werden abgetastet, um endophytischen Pilzbesiedlung bewerten. Hierzu werden Proben einzeln sterilisiert Oberfläche geschnitten in mehrere Abschnitte und inkubiert in Kartoffeldextroseagar Medium für 20 Tage. Die Medien kontrolliert wird alle 2-3 Tage, um Pilz-Wachstum zu beobachtensociated mit Anlagenteilen und notieren das Auftreten von B. bassiana zu schätzen den Umfang ihrer endophytischen Kolonisation. Analysen der Impfung Erfolg vergleichen das Auftreten von B. bassiana innerhalb einer bestimmten Anlagenteil (dh Blätter, Stängel und Wurzeln) über Behandlungen und Kontrollen. Neben der Impfung Verfahren, das konkrete Ergebnis des Experiments kann auf die Zielkultur Art oder Sorte abhängen, belasten die Pilz Entomoerreger Arten oder isolieren verwendet, und die Pflanze Anbaubedingungen.
Fungal Entomopathogens sind wichtige Regulatoren der Insekten-Populationen mit erheblichem Potenzial als mycopesticides 1. Erst kürzlich haben jedoch gezeigt worden pilzlichen Entomoerreger als Endophyten, sowohl natürlich als auch in Reaktion auf verschiedene Methoden Inokulation 2 auftreten. Die ökologische Funktion der endophytischen Pilz Entomopathogens weitgehend unbekannt, aber einige Studien haben sie in das Pflanzenwachstum 3,4, Pflanzenfresser Widerstand 5-8 und Krankheitsresistenz 9,10 verwickelt. Das übergeordnete Ziel der hier vorgestellten Methoden ist es, ein Pilz Entomoerreger als Endophyten einzuführen, in Vorbereitung für spätere Auswertungen endophytischer biologische Kontrolle.
Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) ist die am besten untersuchte endophytischen Pilz Entomoerreger 5-9,11-19, und es ist als kommerzielles mycopesticide. Inokulation Methoden getestet, um festzustellen <em> B. bassiana als Endophyten sind Boden durchnässt 14,17, Samenbeschichtungen 18 und Tauchgänge 14, radicle Dressings 13,15, Wurzel und Rhizom Tauchgänge 11,16,18, Stammzellen-Injektionen 17, Blattsprays 14,17,20 und Blüten Sprays 19. Mit Hilfe dieser Methoden haben die Forscher B. eingeführt bassiana in Bananenblätter 11, bean 7, Kakao 13, Kaffee 17, Mais 7, Baumwolle 7, Dattelpalme 12, Jute 21, Schlafmohn 20, Kürbis 7, radiata Kiefer 18, Sorghum 14, Tomate 7 und Weizen 7. Neuere Erkenntnisse legen nahe, dass endophytischen B. bassiana hat das Potential, nicht nur aus Pflanzen Arthropodenschädlinge 5-7,22-27 schützen, sondern auch aus einigen Pflanzenpathogene 9.
Die gemeinsame Bohne (Phaseolus vulgaris) gehört zu den Pflanzen besonders anfällig für Schädlingeund Krankheiten. Es kann durch mehr als 400 Schädlinge und 200 Erreger, dessen Angriff wird angenommen, dass die Begrenzung der bean Produktionsfaktor in den Regionen 28 werden betroffen sein. Dementsprechend kann der gemeine Bohne ein hervorragendes Modell Ernte sein, um das gesamte Spektrum der endophytischen biologische Kontrolle von B. zu untersuchen bassiana. Als ersten Schritt in diese Richtung, beschreibt dieser Artikel Blattsprays und Boden durchnässt als Impfung Methoden B.bassiana als Endophyten in der gemeinen Bohne vorstellen.
Viele Faktoren können Einfluss auf die konkrete Ergebnis eines Experiments, eine Pilz Entomoerreger als Endophyten zu etablieren. Unsere Ergebnisse zeigen die Inokulation Verfahren ist eines davon. Biologische Faktoren zu experimentieren sind die Pflanzenart oder Sorte ausgewählt und die Pilz Entomoerreger Arten Belastung oder isolieren. Andere Faktoren zu berücksichtigen Manipulation beinhalten die Konzentration des Inokulums, das Alter der Anlage während Impfungen und der Anlage Anbaubedingungen.
Es wäre ideal für eine Impfung Methode der systemischen pflanzlichen Kolonisation durch eine Pilz Entomoerreger 14,17,18,21 führen. Stattdessen geht hervor, dass Methoden zur Inokulation ein spezifisches Muster von lokalen Kolonisierung bevorzugen. In Kaffee beispielsweise begünstigen Blattsprays Blatt Kolonisierung Erwägung Boden Drenchen Wurzelbesiedlung 17 begünstigen. Wir fanden das gleiche Muster in der gemeinsamen Bohne. Letztlich sollte die Wahl der Impfung Methodegeleitet von dem vorgesehenen Standort des Endophyten innerhalb einer Anlage, vermutlich passenden Nische des Ziels Herbivore oder Pflanzenpathogen.
Obwohl häufig verwendet, Endophyten Detektion und Quantifizierung basierend auf Medienkulturen kann teuer werden, schwierig und fehleranfällig. Beispielsweise wurden insgesamt 10.800 Teilanlagen (plattiert auf Petrischalen 1800) in einem Experiment evaluiert nach B. optimieren bassiana Impfungen auf Banane 16. Von diesen wurden 4.496 Abschnitte durch eine vermeintliche B. kolonisiert bassiana, wie sie vor allem durch Kolonie Morphologie identifiziert. Natürlich wäre eine mikroskopische Überprüfung der Arten für jede Kolonie eine wünschenswerte, aber nicht finanzierbare Schritt. Auf der anderen Seite wurden 1176 Teile von anderen Pilzen besiedelt und wurden verworfen und behandelt wie fehlende Daten 16. Die Wahrscheinlichkeit besteht jedoch, dass B. bassiana war ein armer Konkurrenten oder langsamer zu wachsen, und konnte schließlich aus diesen Abschnitten entstanden sind, wenn einllowed genügend Zeit. Daher sind Endophyten Nachweisverfahren auf Medienkulturen Basis unterliegen falsche Positive und falsche Negative. Dementsprechend ist die Entwicklung zuverlässiger Nachweis und die Quantifizierung Methoden, beispielsweise solche auf Basis von Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Assays 20,21,24, ist gut begründet.
Das ultimative Ziel für Impfversuche sollte es sein, eine effiziente Behandlung, die dauerhaft systemische Resistenz gegen Insektenfraß und / oder Krankheit zu entwickeln. Eine plausible, aber noch nicht getestet, ist Hypothese, dass das Ausmaß der endophytischen Kolonisierung sollte positiv korreliert mit dem Ausmaß der Endophyten-vermittelte Resistenz. Eine natürliche nächste Schritt nach Verfeinerung Impfung Methoden, daher könnte es sein, diesen Zusammenhang zu untersuchen. Mehrere Video-Protokolle können Forschern helfen entwerfen eine geeignete Resistenzassay für ein Ziel Schädlings oder Krankheitserregers 29-31. Letztlich ist es dieser Assay, was den Erfolg der Inokula bestimmenmethode und die damit verbundene Potenzial für endophytischen biologische Kontrolle.
The authors have nothing to disclose.
Die Produktion und der experimentellen Arbeiten hier vorgestellten spiegeln die engagierten und enthusiastischen Hilfe von Reynaldo Pareja. Gefördert durch Verwaltungsabteilung Kolumbiens für Wissenschaft, Technologie und Innovation (Colciencias) und durch einen Zuschuss von der Bill & Melinda Gates Foundation durch die Grand Challenges Explorations-Initiative.
REAGENTS | |||
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
Mycotrol SE | Laverlam | 4167 | |
Noble agar | Sigma | A5431-250G | |
Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-25MU | |
Petri dish (100 x 15 mm) | Fisher | 08-757-12 | |
Petri dish (60 x 15 mm) | Fisher | 08-757-13A | |
Potato dextrose agar | Difco | 213400 | |
Regular bleach (NaOCl) | CLOROX | N/A | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
Tetracycline | Sigma | T3258-25G | |
Triple quince (NPK) | ABOCOL | N/A | |
Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
EQUIPMENT | |||
Biological safety cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
Leica DM LB microscope | Leica | N/A |