Identificazione Peptide-based di Motivi funzionali e dei loro partner di legame

Summary

Tecniche di sezionare i meccanismi alla base della secrezione del virus HIV-1 Nef in exosomes sono descritti. Peptidi brevi specifici derivati ​​dalla Nef e trasfezione di proteine ​​sono stati sfruttati per determinare la struttura, la funzione, e partner di legame di di Nef secrezione Modification Regione. Queste procedure hanno rilevanza generale in molti studi meccanicistici.

Abstract

Brevi peptidi specifici derivati ​​da motivi trovati nelle proteine ​​integrali, nel nostro caso di HIV-1 Nef, conservano non solo la loro funzione biologica, ma possono anche inibire competitivamente la funzione della proteina intera. Un insieme di 20 Nef peptidi di scansione, 20 aminoacidi di lunghezza con ogni sovrapposizione di 10 amminoacidi del suo vicino di casa, sono stati utilizzati per identificare i motivi in ​​Nef responsabile per la sua induzione di apoptosi. Peptidi contenenti tali motivi apoptotico indotto apoptosi a livelli comparabili alla proteina Nef intera lunghezza. Un secondo peptide, derivato dal Modification Regione secrezione (SMR) della Nef, ha mantenuto la capacità di interagire con le proteine ​​cellulari coinvolte nella secrezione di Nef in exosomes (exNef). Questo peptide SMRwt stata utilizzata come proteina "esca" in esperimenti di co-immunoprecipitazione per isolare proteine ​​cellulari che si legano specificamente alla SMR motivo di Nef. Proteina trasfezione e anticorpo inibizione è stato utilizzato per interrompere fisicamente la scommessa interazioneween Nef e mortalin, una delle proteine ​​SMR vincolanti isolate, e l'effetto è stato misurato con un test di secrezione exNef fluorescente-based. La capacità del peptide di SMRwt outcompete full-length Nef per le proteine ​​cellulari che legano il motivo SMR, ne fanno il primo inibitore della secrezione exNef. Così, impiegando le tecniche descritte qui, che utilizzano le proprietà uniche di brevi peptidi specifici derivati ​​da motivi trovati nelle proteine ​​integrali, si può accelerare l'identificazione di motivi funzionali nelle proteine ​​e lo sviluppo di inibitori basati sul peptide di funzioni patogeni.

Introduction

Con l'avvento della terapia antiretrovirale, l'epidemia di AIDS nel mondo occidentale è stato rallentato, ma non ridotto, e la diffusione di HIV continua ad essere un grave problema di salute in tutto il mondo. Con l'eccezione del marginalmente efficace prova RV144 Thai, vaccini contro l'HIV hanno finora dimostrato incapacità di proteggere dalle infezioni. Così, la ricerca di ulteriori potenziali bersagli terapeutici, è ancora giustificata.

Insieme con CD4 deplezione delle cellule T, persistente attivazione immunitaria generalizzata è un marchio di garanzia di infezione da HIV. L'attivazione immunitaria cronica (CIA) implica un miglioramento della turnover cellulare, sottopopolazioni linfocitarie attivate e differenziate, stanchezza e la senescenza cellulare, e l'uccisione delle cellule T e le cellule B mediante l'attivazione indotta Cell Death (AICD) ^1,2,3, e esso è ben definito come uno dei più forti predittori di progressione della malattia ^{4,5,6,7,8,9,10,11,12.} Tuttavia, i meccanismi alla base della CIA e CD4Deplezione di infezione da HIV delle cellule T devono ancora essere completamente chiarito.

La prova dal nostro laboratorio e altri ci ha portato a un modello di progressione della malattia (Figura 1) in cui la proteina Nef di HIV (fattore di regolazione negativa) induce la secrezione di exosomes da HIV-1 le cellule infette ^13,14. Questi exosomes Nef contenenti (exNef) inducono apoptosi in un certo numero di linee cellulari tra cui cellule CD4 non infetti le cellule T ^15,16. In alternativa, nei monociti / macrofagi exNef altera i pattern di espressione genica, ad esempio, l'espressione di citochine, e sembra indurre uno stato di attivazione del sistema immunitario non in programma. Questo corpo di evidenza suggerisce un ruolo importante per exNef nella CIA e CD4 deplezione delle cellule T.

La comprensione dei meccanismi alla base della capacità di Nef di manipolare il percorso traffico exosomal sarà utile in nuovi inibitori di ingegneria di secrezione exNef. Inibizione della secrezione exNef dovrebbe diminuire il CD4 deplezione di cellule Te la CIA che guidano l'HIV / AIDS patogenesi.

Per raccogliere le prove che hanno portato il nostro modello di progressione della malattia da HIV / AIDS ei dati successivi che hanno costruito su questo modello, abbiamo sviluppato una serie di nuovi reagenti e delle metodologie che ci ha permesso di analizzare la genetica di secrezione exNef, e cominciamo a determinare la proteine ​​cellulari coinvolte. Nel lavoro iniziale, abbiamo scoperto che la proteina Nef induce apoptosi nelle cellule bystander extracellulare e viene rilasciato dalle cellule transfettate Nef e HIV-infetti ^15. Peptidi derivati ​​da (cellula stromale Derived Factor-1, con l'alfa splicing alternativo) SDF-1α erano stati precedentemente dimostrato di mantenere gran parte della attività di legame e segnalazione della molecola intera lunghezza ^17. Abbiamo ipotizzato che i peptidi di Nef potrebbero mantenere alcune delle attività apoptotica della proteina integrale, e che questi peptidi sarebbero necessariamente contenere il dominio apoptotico Nef (s). Per identificare questi peptidi, e di conseguenza la Nefdominio apoptotica (s), si ottiene un insieme di 20 HIV-1 Nef peptidi scansione dal AIDS Research NIH e Programma reagente di riferimento. Questi peptidi 20-AA, ogni sovrapposizione di 10 amminoacidi del suo vicino di casa, prendono il nome dal numero del loro ultimo aminoacido, cioè N20 campate Nef aminoacidi 1-20, N30 campate Nef aminoacidi 11-30, ecc ^16. Abbiamo trovato che esponendo cellule T extracellulare di peptidi specifici sovrapposti due domini distinti 10-aa nella proteina Nef intera lunghezza apoptosi indotta in queste cellule. Successiva analisi di questi peptidi apoptotici Nef-derivati ​​rivelato la loro capacità di interagire fisicamente con il recettore della chemochina CXCR4 sulla superficie delle cellule T, con cinetiche di legame che permettevano questi peptidi di inibire competitivamente vincolante tra CXCR4 e il suo ligando naturale SDF-1α. Infine, l'interazione dei peptidi derivati ​​Nef-apoptotiche 'con CXCR4 è stato trovato per indurre una risposta allo stress in queste T-cellule portano all'apoptosi. Questa prova ci ha permesso di Quicdomini funzionali di kly mappa Nef, un processo che avrebbe richiesto molto più tempo utilizzando tecniche di mutagenesi del DNA standard, quali alanina scansione mutagenesi. Essa ha anche mostrato che questi peptidi corti Nef-derivati ​​mantenuti la funzione biologica dei domini apoptotici nella proteina intera.

Dopo aver identificato un ruolo per Nef extracellulare, cioè l'apoptosi delle cellule T, abbiamo cercato una migliore comprensione di come Nef è stato secreto dalle cellule. Utilizzando una serie di costrutti Nef mutati, abbiamo mappato altamente conservate motivi proteine ​​Nef nelle regioni N-terminali di entrambi HIV Nef, e il suo macaco Rhesus equivalente _mac SIV (Simian Immunodeficiency Virus) Nef, che sono fondamentali per exNef secrezione ^13. Uno di questi motivi, la modifica Regione secrezione (SMR; 66VGFPV70), è stato particolarmente critico, come la sostituzione di alanina di uno dei suoi cinque aminoacidi sia notevolmente ridotto o abolito secrezione exNef. Quando consegnato alle cellule tramite del Soggetto attivo CHariot proteine ​​reagenti di consegna, un peptide contenente la SMR attaccato ad una sequenza peptidica FLAG (SMRwt) è stato trovato per inibire la secrezione exNef sia da Nef transfettate e infezione da HIV cellule ^18. Sulla base della nostra esperienza precedente con i peptidi, abbiamo deciso di utilizzare questo peptide per chiarire le molecole ei meccanismi alla base del ruolo della Nef SMR nella secrezione exNef.

Usando il peptide SMRwt come il nostro "proteina esca", abbiamo co-immunoprecipitata cellulari partner di legame degli SMR non infetti da lisati di cellule T ^18. La sequenza del peptide FLAG disponibile una comoda maniglia per catturare il peptide SMRwt utilizzando anticorpi anti-FLAG resina di affinità. La nostra precedente scoperta che un singolo valina per alanina mutazione del peptide SMRwt era sufficiente per eliminare la sua inibizione della secrezione exNef identificato una comoda, peptide di controllo altamente specifico (SMRmut) che abbiamo usato per escludere le proteine ​​co-immunoprecipitate non specifici per l'SMR. Utilizzando un peptide con la sdominio pecific di interesse piuttosto che la proteina full-length ci ha permesso di bypassare la proiezione di decine di fattori cellulari che si legano ad altri domini in Nef ^19.

Una volta che abbiamo identificato i partner SMR vincolanti, un passo logico successivo è stato quello di dimostrare che i partner di legame cellulari individuati sono importanti per la funzione biologica ^18. La procedura standard per farlo è a livelli proteici knockdown utilizzando miRNA proteina bersaglio-specifici o siRNA, e successivamente il dosaggio effetto sulla funzione biologica. Abbiamo effettuato miRNA smontabile, che inibisce traduzione del mRNA bersaglio, riducendo la produzione di tale obiettivo, in questo caso una proteina SMR-binding. Questa riduzione della proteina bersaglio è un effetto indiretto, e possibilmente ha un effetto ritardato sulla funzione biologica della proteina mirata svolge un ruolo pollici conseguenza, abbiamo anche impiegato la tecnica inibizione anticorpo meno comune per determinare se interrompere direttamente l'attività deila proteina bersaglio riduce o elimina la funzione biologica. In questa procedura, anticorpi contro la proteina mirati sono trasfettate nella cella usando Carro reagente, e interagire direttamente con la proteina bersaglio o sequestrare dal suo sito di funzione, o bloccando la sua rilevante dominio di legame. Inibizione della proteina bersaglio attraverso questa procedura interrompe direttamente la sua funzione, e può integrare procedure abbattibili RNA confermando ulteriormente l'importanza della proteina bersaglio per la funzione biologica.

Mentre Chariot reagente è efficace a fornire peptidi e proteine ​​nelle cellule, questo processo richiede tempo e limita i tipi di esperimenti, ad esempio, esposizioni prolungate o ripetute e in studi su animali in vivo, che può essere eseguita. Di conseguenza, abbiamo aggiunto un peptide (CPP) sequenza di celle-penetrante al SMRwt peptide (SMRwt-CPP) ¹⁸ per generare un peptide che potrebbe essere assorbita dalle cellule passivamentedai mezzi di coltura. Questa versione è risultato efficace quanto il primo a secrezione exNef inibizione.

L'evidenza da questi esperimenti pubblicati dimostra la capacità di piccoli peptidi contenenti specifici motivi funzionali di antagonizzare la funzione della proteina intera per inibizione competitiva, e per isolare le proteine ​​che legano questi motivi. Ci si aspetterebbe che queste tecniche dovrebbero essere utili in molti protocolli sperimentali. Essi dovrebbero anche essere efficace in ingegneria nuovi inibitori peptidici di molti processi cellulari, una funzione che può essere ulteriormente migliorato legame a sequenze CPP.

Protocol

I. Utilizzo di brevi peptidi in analisi biologica

I.1. Mappatura Motivi Biologicamente Funzionali Peptidi

1. Trattando le cellule con Nef peptidi di scansione
   1. Procurarsi un insieme di peptidi scansione della regione di interesse. Per i nostri esperimenti, peptidi 20mer, con 10 sovrapposizione aminoacidi, che coprono l'intera HIV-1 Nef proteina (205 aa), sono stati ottenuti dal Programma reagente AIDS. I peptidi sono saggiati singolarmente come segue:
   2. Aggiungere 10 ng / ml di peptide per mezzo di coltura cellulare.
   3. Aggiungere 10 ml di mezzo di coltura per piastra per colture cellulari Jurkat.
   4. Incubare culture per 24 ore a 37 ° C.
2. Terminal deoxynucleotidyltransferase-mediata dUTP biotina Nick End Labeling (TUNEL) saggio di apoptosi
   1. Lavare le cellule con 1X PBS, e fissare per 30 min a temperatura ambiente con 4% paraformaldeide in 1X PBS, pH 7,4.
   2. Lavare con 1X PBS, e permeabilize con 0,1% Triton X-100 per 10min a temperatura ambiente.
   3. Lavare le cellule due volte con PBS 1X.
   4. Contare le cellule colorate con epifluorescenza su un sistema di microscopia controllato dal computer.

I.2. Analisi inibizione competitiva utilizzando peptidi

1. La co-trasfezione di peptidi utilizzando il Carro Protein consegna kit reagenti
   1. Per ogni miscela di reazione di trasfezione, diluire 1 pg di wtNef-GFP DNA plasmidico e 100 ng di tipo selvatico sia peptidi derivati ​​dal dominio SMR, o peptidi contenenti alanina-sostituzioni di singoli aminoacidi nel motivo SMR, ad un volume finale di 100 microlitri con 1X PBS.
   2. Diluire 6 pl di una diluizione di Chariot Reagente 1/10 ad un volume finale di 100 microlitri di acqua sterile, e si combinano con la miscela diluita DNA-peptide.
   3. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti per permettere la formazione del Carro / complesso DNA-peptide.
   4. Pellet 3 x 10 ⁵ cellule Jurkat per centrifugazione a 600 xg per 5 min.
   5. Lavare le cellule due volte con PBS 1X e risospendere nel complesso Chariot / DNA-peptide.
   6. Aggiungere 400 microlitri di siero terreno RPMI 1640 alla sospensione e incubare le cellule in piastre di coltura a 37 ° C per 2 h.
   7. Aggiungere 1 ml di fresco RPMI 1640 contenente 10% FBS per ciascuna piastra, e incubare le cellule per 48 ore a 37 ° C.
   8. Celle di raccolta e di determinare l'efficienza di trasfezione mediante microscopia a fluorescenza.
2. Nef-GFP secrezione fluorescente piatto saggio lettore di inibizione peptide
   1. Raccogliere i media condizionata, privi di cellule dalle cellule raccolte, e trasferire 100 ul a singoli pozzetti di una micropiastra a 96 pozzetti nero.
   2. Misura fluorescenza GFP nei media su un Tecan GENEios fluorimetro con lunghezza d'onda di eccitazione 485 nm e 515 nm di lunghezza d'onda di emissione in unità fluorescenti relativi.
   3. Impostare il livello di fluorescenza GFP nel controllo (supporti da cellule co-trasfettate con Nef-GFP e un strapazzate peptide) A 100%.
   4. Confrontare questo al livello di fluorescenza GFP nei media dalle cellule co-trasfettate con vari peptidi SMR per determinare cambiamenti nella secrezione Nef-GFP.

I.3. Isolando Motif Partners associazione utilizzando peptidi come esca

1. Co-immunoprecipitazione con peptidi SMR
   1. Coltivare le cellule Jurkat in RPMI 1640 contenente 10% FBS a 37 ° C in un pallone di coltura tissutale T-75, e le cellule pellet per centrifugazione a 1000 xg per 20 min a 4 ° C. Determinare l'efficienza di trasfezione, collocando la lastra sotto un microscopio a fluorescenza, acquisire immagini, e successivamente contare le cellule totali etichettati e determinare le cellule marcate cento.
   2. Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di PBS 1X, e trasferirlo in una provetta Eppendorf da 1,5 ml. Microcentrifuga a 1.000 xg per 1 min. Risospendere il pellet in 1 ml di α-FLAG tampone di lisi per pipettaggio delicato. Tampone di lisi: Mix 50 mM Tris • HCl pH 7.4, 150 mM sodio chloride [NaCl], 1 mM EDTA, e 1% Triton X-100, con 1 mM PMSF [PMSF], e 10 microlitri / ml di cocktail inibitore di proteasi per uso con cellule di mammifero ed estratti tissutali [PIC; Sigma]. Fai subito prima dell'uso.
   3. Differenzialmente microcentrifuga le sospensioni a 2.000 xg per 5 min, e a 13.000 xg per 10 min a pellet i detriti cellulari e il DNA, rispettivamente. Raccogliere il surnatante (qui di seguito denominata la "lisato").
   4. Aggiungere 1 mg di proteina lisato e 1 mg sia del SMRwt o SMRmut peptide di 20 l di anti-FLAG M2 Affinity Gel (qui di seguito denominata "resina", Sigma). Si noti che sia SMRwt e SMRmut usato qui hanno una sequenza di tag bandiera incorporata nei peptidi. Portare la miscela a un volume finale di 1 ml in tampone Co-IP (α-FLAG Lysis buffer meno PMSF e PIC). Incubare la miscela a 4 ° C per una notte con rotazione end-over-end. Come controllo negativo, incubare il lisato con la resina in assenza di entrambi peptide.
   5. Pellet resina mediante microcentrifugation a 5000 - 8000 xg per 30 sec. Lasciare resina riposare per 2 minuti prima di maneggiare il campione e poi aspirare il surnatante. Rimuovere il surnatante con una pipetta stretta-end, o una siringa Hamilton, facendo attenzione a non trasferire la resina. Puntali Narrow-end possono essere effettuate utilizzando pinze per pizzicare l'apertura di un puntale di plastica fino a quando non viene parzialmente chiusa. Lavare la resina quattro volte con 500 microlitri di tampone di lavaggio (50 mM Tris HCl pH 7,4 •, e 150 mM NaCl). Eluire le proteine ​​cellulari associate con 15 pg di peptide FLAG 3X (Sigma) in 50 ml di tampone di lavaggio e incubare a bilico / agitatore per 30 min a temperatura ambiente.
   6. Concentrare gli eluati per precipitazione acetone, seguito da bollire in tampone Laemmli (Bio-Rad). Separare le proteine ​​mediante SDS-PAGE su un 4-20% Tris-HCl Criterion prefabbricati gel (Bio-Rad). Macchiare il gel con Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad). Nota: per gli esperimenti di identificazione di spettrometria di massa ( Figura 4A), ciascuna condizione (Co-IP con SMRwt, SMRmut, o nessun peptide) è stata eseguita in quadruplicato, e gli eluati da tutti quattro repliche sono stati raccolti insieme prima di acetone precipitazione per un totale di 4 mg di proteina totale immessa / condizione).
2. Co-immunoprecipitazione con proteina Nef-GFP
   1. Mescolare 50 ml di proteina G Dynabeads sfere magnetiche (Invitrogen) con 2 pg di anticorpo monoclonale murino anti-GFP in 1 ml di 1X PBS con 0,02% di Tween 20 (PBS-T). Incubare la miscela con rotazione end-over-end in una provetta Eppendorf da 1,5 ml per 1 ora a 4 ° C.
   2. Separare le perline dal buffer ponendo la provetta in un 1,5 ml Magnasphere Tecnologia basamento separazione magnetica (Promega Corp., Madison, WI) permettendo pulldown magnetica seguita dalla rimozione del supernatante. Lavare le perline rivestite anti-GFP con 1 ml di PBS-T utilizzando pipettaggio delicato.
   3. Lyse Nef-GFP cellule Jurkat trasfettate con 1 ml di 1X RIPA + tampone pipettando dolce e incubazione per 15 min su ghiaccio. RIPA + buffer: 10X RIPA Lysis Buffer, pH 7.4 [Millipore, Bedford, MA] 1:10 diluita in acqua sterile, 0,02% di sodio azide [sigma], e il 0,1% di sodio dodecil solfato [SDS], con 1 mM PMSF e 10 microlitri / ml PIC aggiunto immediatamente prima dell'uso.
   4. Pellet i detriti cellulari da microcentrifugation a 2.000 xg per 10 min. Raccogliere il surnatante (qui di seguito denominata la "lisato").
   5. Aggiungere 1 mg di proteina lisato alle perline rivestite di anti-GFP, portare il volume finale di 1 ml con 1X tampone RIPA +, ed incubare la miscela con rotazione end-over-end per 1 ora a 4 ° C. Nota: Per gli studi di peptide concorrenza, 1 mg di proteina lisato può essere pre-incubate con 2 mg di SMRwt o SMRmut peptide in 1 ml di 1X RIPA + tampone, prima di essere aggiunti alle perle rivestite anti-GFP.
   6. Lavare le perline mediante risospensione in 1 ml di tampone di lavaggio (50 mM Tris • HCl pH 7,4, 150 mM NaCl e 0,1% di Tween 20). Incubare con rotazione end-over-end per 5 minuti a 4 ° C. Separare le perline from il lavaggio con il supporto separazione magnetica. Lavare le perle di una seconda e terza volta con tamponi di lavaggio contenenti 250 mM e 300 mM di NaCl, rispettivamente.
   7. Risospendere le sfere in 200 microlitri di PBS, trasferire la miscela in una provetta pulita, e separare le perline dal lavaggio sul supporto magnetico. Lessate le perline in 50 ml di campione Laemmli buffer di 5 min a 95 ° C, lasciare raffreddare il composto per 10 minuti a temperatura ambiente, e poi mettere il composto sul supporto magnetico per la separazione, e raccogliere il surnatante ("eluati") .
   8. Separare le proteine ​​del eluato da SDS-PAGE su un Tris-HCl Criterion gel prefabbricato 8-16%.
3. Spettrometria di massa
   1. Accise le bande proteiche di interesse dal gel Coomassie macchiati.
   2. Ridurre i campioni in 10 mM 1,4-ditiotreitolo (DTT) per 45 min a 37 ° C.
   3. Alchilata i campioni a 55 mm iodoacetamide per 45 min a 25 ° C.
   4. Digerire i campioni durante la notte con il sequenziamento tentativo di gradoPSIN (Promega) a 37 ° C.
   5. Desalt i peptidi di esempio con C-18 ZipTip (Millipore). Mescolare i peptidi del campione con alfa-CHC Matrix (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), e individuarli su una MTP bersaglio telaio III (Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA).
   6. Eseguire tandem laser desorbimento / ionizzazione volta assistita dalla matrice di volo (MALDI-TOF/TOF) spettrometria di massa utilizzando un Bruker Daltonics Ultraflex III TOF / TOF.
   7. Confrontare i dati MS / MS per i database non ridondanti e Swiss-Prot NCBI utilizzando l'algoritmo di Mascot ( www.matrixscience.com ).
4. Immunoblot analisi
   1. Separare i campioni di proteine ​​mediante SDS-PAGE il 4-20% o 8-16% Tris-HCl Criterion prefabbricati gel (Bio-Rad). Trasferire le bande elettroforesi su una membrana di nitrocellulosa.
   2. Lavare la membrana in soluzione salina tamponata Tris (TBS, Bio-Rad) per 5 min. Bloccare con il 5% di latte scremato in TTBS (TBS con il 0,1% di Tween 20) per 1 ora agitando a temperatura ambiente.
   3. Elaborare la membrana per immunoblotting usando uno specifico anticorpo primario in 5% di latte scremato in agitazione a 4 ° C durante la notte. Lavare in TTBS per 20 min seguito da un coniugato HRP IgG (H + L) anticorpo secondario in 5% di latte scremato per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare in TTBS per 30-60 min.
   4. Rileva le bande di proteine ​​mediante Western Blotting Luminol Reagent (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Esporre il filtro a pellicola fotografica. Nota: In alcuni esperimenti, un reagente di strippaggio è stato utilizzato per striscia la membrana (Pierce, Rockford, IL) con successiva ibridazione con un anticorpo primario e secondario diverso.
   5. Eseguire la scansione delle pellicole radiografiche in Adobe Photoshop 5.0.2. Eseguire l'analisi densitometrica utilizzando il software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

II. L'uso di anticorpi Inibizione in Analisi Funzionale

II.1. La co-trasfezione di anticorpiIES utilizzando il Carro Protein consegna kit reagenti

1. Per ogni miscela di reazione di trasfezione, diluire 1 pg di wtNef-GFP DNA plasmidico e 1 mg di anticorpo anti-sia mortalin o anti-α-tubulina anticorpo, per un volume finale di 100 microlitri di PBS 1X. Nota: Precedentemente scoperto che la co-trasfezione del anticorpo anti-α-tubulina ha alcun effetto rilevabile sulla secrezione exNef, e, quindi, serve come un efficace controllo negativo in questi esperimenti.
2. Diluire 6 pl di reagente non diluito Chariot ad un volume finale di 100 microlitri di acqua sterile, e combinare con la miscela di DNA-anticorpo diluito.
3. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti per permettere la formazione del Carro / complesso DNA-anticorpo.
4. Pellet 3 x 10 ⁵ cellule Jurkat per centrifugazione a 600 xg per 5 min.
5. Lavare le cellule due volte con PBS 1X e risospendere in Chariot / complesso DNA-anticorpo.
6. Aggiungere 400 microlitri di siero terreno RPMI 1640 alla sospensione e incubare la cells in piastre di coltura a 37 ° C per 2 ore.
7. Aggiungere 1 ml di fresco RPMI 1640 contenente 10% FBS per ciascuna piastra, e incubare le cellule per 48 ore a 37 ° C.

II.2. Nef-GFP secrezione Fluorescente Piastra Reader Saggio di anticorpo Inibizione

1. Raccogliere i media condizionata, privi di cellule dalle cellule raccolte, e trasferire 100 ul a singoli pozzetti di una micropiastra a 96 pozzetti nero.
2. Misura fluorescenza GFP nei media su un Tecan GENEios fluorimetro con lunghezza d'onda di eccitazione 485 nm e 515 nm di lunghezza d'onda di emissione in unità fluorescenti relativi.
3. Impostare il livello di fluorescenza GFP nel controllo (supporti da cellule co-trasfettate con Nef-GFP e anti-α-tubulina anticorpo) a 100%.
4. Confrontare questo al livello di fluorescenza GFP nei media dalle cellule co-trasfettate con anticorpo anti-mortalin per determinare cambiamenti nella secrezione Nef-GFP.

Results

Mappatura Motivi biologicamente funzionale utilizzando peptidi. Due regioni sono state identificate sulle proteine ​​Nef che inducono l'apoptosi. Apoptosi Peptide-driven è stato osservato (Figura 2) che inizia con peptide N50 (AA30-50), con un picco a N60 (AA40-60) e N70 (AA50-70), e la diminuzione di livelli di fondo di peptide N100 (aa80-100). Il principale Motif 1 (M1) di picco, centratura su AA50-60, induce> 80% dei livelli apoptotici della proteina Nef intera lunghezza. Un secon...

Discussion

La comprensione dei meccanismi alla base della capacità di Nef di manipolare il percorso traffico exosomal sarà utile in nuovi inibitori di ingegneria di secrezione exNef. L'inibizione della secrezione exNef dovrebbe diminuire la deplezione delle cellule T CD4 e della CIA che guidano l'HIV / AIDS patogenesi. Verso questo obiettivo, abbiamo sviluppato una serie di nuovi reagenti e delle metodologie che ci ha permesso di analizzare la genetica di secrezione exNef, e cominciamo a determinare le proteine ​​cellulari...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Set di peptidi 20mer con sovrapposizione di 10 aminoacidi	Programma di reagenti di ricerca e riferimento NIH AIDS	4641
TUNEL Assay	Roche	11 684 809 910
Chariot Protein Delivery Reagent	Active Motif	30100
Fluorimetro Tecan GENEios	(Tecan Group, Svizzera)
Piastra per microtitolazione nera a 96 pozzetti	Corning	3792
anti-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma	A2220
Dynabeads Protein G perline magnetiche	Invitrogen	100.03D
MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (due posizioni)	Promega Corp., Madison, WI	Z5332
C-18 ZipTip	Millipore	ZTC18S096	Resina C18 (0,6 μ l o 0,2 μ l volumi del letto). Gli oligonucleotidi o piccoli (< 50 kDa) proteine/peptidi in soluzione acquosa
MALDI TOF/TOF	Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF