Articolo metodologico

Un metodo per l'isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione

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DOI:

10.3791/50374

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25 giugno 2014

 ,  ,  , 
1Department of Nutrional Sciences, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Medicine, Division of Endocrinology, Diabetes, and Metabolism, University of Wisconsin-Madison, 3School of Pharmacy, University of Waterloo

In questo articolo

Sommario

Saggio funzione in vitro β-cellulare utilizzando isolate del mouse isole di Langerhans è una componente importante nello studio della fisiopatologia del diabete e terapeutica. Mentre molte applicazioni a valle sono disponibili, questo protocollo descrive specificamente la misurazione di intracellulare adenosina monofosfato ciclico (cAMP) come parametro essenziale determinare la funzione β-cellulare.

Abstract

La glicemia incontrollata è una caratteristica del diabete mellito e promuove patologie come la neuropatia, nefropatia e retinopatia. Con la crescente prevalenza del diabete, sia immuno-mediata di tipo 1 e obesità legati tipo 2, gli studi volti a delineare fisiopatologia del diabete e dei meccanismi terapeutici sono di importanza critica. I β-cellule delle isole pancreatiche di Langerhans sono responsabili opportunamente secrezione di insulina in risposta a concentrazioni di glucosio nel sangue. Oltre al glucosio e altri nutrienti, i β-cellule sono stimolate dagli ormoni specifici, incretins, che sono secreti dall'intestino in risposta ai pasti e agire sui recettori β-cellule che aumentano la produzione intracellulare di adenosina monofosfato ciclico (definito cAMP). Diminuzione della funzione β-cellulare, massa, e la reattività incretine sono ben compresi, per contribuire alla fisiopatologia del diabete di tipo 2, e sono anche sempre più collegate with diabete di tipo 1. L'attuale topo isolamento delle isole e il protocollo determinazione cAMP possono essere uno strumento per aiutare a delineare i meccanismi che promuovono la progressione della malattia e gli interventi terapeutici, in particolare quelli che sono mediate dai recettori incretine o recettori che agiscono attraverso la modulazione della produzione di cAMP intracellulare legato. Mentre saranno descritte soltanto misurazioni cAMP, il protocollo di isolamento isolotto descritto crea un preparato pulito che consente anche per molte altre applicazioni a valle, come il glucosio stimolata la secrezione di insulina, [3 H]-timidina, proteine ​​abbondanza, e l'espressione di mRNA.

Introduzione

La rigorosa manutenzione di euglicemia è indispensabile per evitare morbosità come la neuropatia, nefropatia e retinopatia, che sono tutte caratteristiche della patologia di incontrollata di tipo 1 e 2 il diabete 1. Funzione β-cellulare ridotto e di massa sia di tipo 1 e diabete 2 perturbano le concentrazioni di glucosio nel sangue 2. Considerando che tipo immuno-mediata 1 diabete risultati da una perdita devastante di β-cellule che producono insulina, alterata secrezione di insulina β-cellulare e la segnalazione periferica all'insulina nel diabete di tipo 2 insieme promuovono iperglicemia, dislipidemia, e aumento della produzione epatica di glucosio, che alla fine si traduce in sia la perdita della massa β-cellulare e la secrezione di insulina capacità da singoli β-cellule 3. La comprensione dei meccanismi alla base β-cellule nella progressione di tipo 1 e diabete 2 si spera, darà luogo a nuove terapie per prevenire e curare queste malattie.

In vitro timodelli di coltura SSUE, come l'INS-1 e MIN6 immortalati linee di β-cellule, possono essere strumenti utili per la comprensione delle funzioni β-cellulari specifici. Tuttavia, le interazioni tra i diversi tipi cellulari all'interno isolotto si possono regolare la funzione β-cellulare. Ad esempio, l'influenza paracrina di glucagone (rilasciato da α-cellule) e somatostatina (rilasciato da δ-cellule) in aumentando e diminuendo la secrezione di insulina, rispettivamente, dimostra l'importanza della prossimità cella cella nella risposta endocrina 4. Inoltre, giunzioni gap tra β-cellule potenziano il rilascio di insulina 5. Inoltre, sebbene progressi sono stati fatti nel generare linee insulinoma che meglio replicato la risposta fisiologica di isole isolate al glucosio (ad esempio, l'INS-1-derivato 832/13 e 832/3 linee cellulari), la rispondenza glucosio differenti rispetto ratto normale isolotti 6,7. Inoltre, la risposta di queste linee cellulari clonali insulinomaal peptide-1 (GLP-1) agonisti glucagone-simile possono differire notevolmente l'uno dall'altro, così come da isolotti normali 6. Pertanto, le linee cellulari immortalizzate non possono rappresentare il modello migliore per saggiare gli agenti che hanno un impatto sulla produzione di cAMP.

In contrasto con le linee cellulari derivate insulinoma, studiando funzione β-cellula esclusivamente in modelli animali interi offre una propria serie di complicazioni. Una delle maggiori sfide nel lavoro con tessuto endocrino sta misurando la concentrazione precisa di ormone rilasciato. In particolare, il fegato gioca un ruolo importante metabolizzare insulina, e il pancreas flusso sanguigno va direttamente al fegato. Così, una misura insulinemia non può ritrarre con precisione le quantità di insulina essere secreti dal pancreas stesso o l'impatto di trattamenti diversi sul tasso di secrezione insulinica 8. Inoltre, il metabolismo renale di glucagone può limitare l'affidabilità di uscita glucagone dall'Islet α-cellule 9. Pertanto, isolando isole primari di topo per la sperimentazione in vitro fornisce una comprensione più precisa di come l'isolotto sta rispondendo a stimoli specifici per integrare le misurazioni effettuate in vivo.

Il presente protocollo per l'isolamento di isole di topo è un protocollo ben consolidata utilizzato da un certo numero di gruppi (con lievi modifiche che possono contribuire ad aumentare il successo) 10,11. Inoltre, la determinazione della produzione di cAMP consente una lettura diretta della reattività incretin delle β-cellule. In combinazione con la misurazione cAMP, contenuto proteico e la secrezione di insulina possono anche essere quantificato dal medesimo preparazione del campione cAMP, contribuendo a determinare se un difetto nella funzione β-cellula si trova prossimale o distale di cAMP 10. Il contenuto di cAMP e l'applicazione finale secrezione insulinica in questo protocollo può essere uno strumento molto potente per comprendere l'influenza delle componenti farmaceutici, alimentari, tra l'altros, in cAMP e la secrezione di insulina. Oltre alla stimolazione da solo glucosio, altri composti possono essere utilizzati per misurare le variazioni di cAMP e secrezione insulinica 10,11.

Infine, anche se l'insulina è il principale ormone che saggio da isole isolate, altri ormoni, quali il glucagone e la somatostatina, così come le citochine, eicosanoidi e adenosina monofosfato ciclico, può anche essere misurata, mediante un saggio stimolazione transiente o quantificazione di ai livelli del terreno di coltura 12. Infine, anche se al di fuori del campo di applicazione di questo manoscritto, isolamento delle isole con il metodo di isolamento collagenasi descritto consente per la conservazione isolotto in modo che molte altre applicazioni a valle possono essere perseguiti, come il trapianto di isole, l'isolamento di RNA per quantitativa in tempo reale PCR o microarray analisi, proteine isolamento per Western blotting, isolotto incorporamento e di imaging immunofluorescenza, e l'incorporazione di [3H]-timidina come misura di replicazione delle cellule insularizione, alcuni dei quali sono stati descritti in precedenti articoli JoVE 13-16. Nel complesso, seguendo la procedura di isolamento delle isole descritta nel protocollo può fornire un ricercatore con informazioni importanti e utili per lo sviluppo di terapie e promuovere la scoperta di farmaci volti a migliorare la funzione β-cellulare.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità a tutte le linee guida, regolamenti e agenzie di regolamentazione. Il protocollo ha dimostrato di essere stata eseguita sotto la guida e l'approvazione della cura degli animali e uso Comitato Istituzionale (IACUC) della University of Wisconsin-Madison.

1. Preparazione di soluzioni

  1. Il metodo di eutanasia in questo protocollo è dissanguamento sotto anestesia Avertin (per una rassegna delle alternative, vedi la discussione). Per rendere Avertin, aggiungere 0,625 g (1,25% o 44,2 mM) di 2-2-2 tribromoethanol a 1,25 ml di 2-metil-2-butanolo in un tubo da 15 ml e scaldare a 37 ° C per 20-30 min. Agitare la soluzione in alto per 10-15 secondi alla volta per sciogliere completamente il 2-2-2 tribromoethanol. Una volta completamente sciolto, aggiungere la soluzione a 48,75 ml della doppia H 2 O distillata, filtrare attraverso un filtro da 0,45 micron in un nuovo tubo conico da 50 ml, avvolgere i 50 ml conicheal tubo in un foglio di alluminio e conservare a 4 ° C per un massimo di un mese. Portare il tubo di RT prima di iniettare topi.
  2. Per rendere soluzione salina bilanciata Hanks '(HBSS), portare a 1 L 1x HBSS da uno stock di 10x (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA) in camera doppia H 2 O distillata, aggiungere 0,35 g (4,2 mm) nacho 3, e conservare a 4 ° C per 1 mese. Per ogni mouse, 105 ml di questa soluzione (più di 5-10 ml in più per pipettaggio errore) saranno necessari per l'isolamento delle isole.
  3. Isolotti sono molto sensibili al danno ipossico; Pertanto, HBSS è gorgogliare con 95% O 2/5% di CO 2 per simulare le concentrazioni di O 2 nel sangue. Miscele speciali di gas possono essere acquistati e una stazione spumeggiante impostato con una pipetta Pasteur attaccato al tubo flessibile. Dopo gorgogliare la quantità necessaria di HBSS con 95% O 2/5% di CO 2 per 15 minuti, aggiungere 0,02% BSA grado RIA (albumina sierica bovina) in volume e mantenere in ghiaccio per il remainder dell'isolamento isolotto.
  4. Per la preparazione Ficoll, pesare 32,5 g di Ficoll in un becher da 400 ml, aggiungere 80 ml di HBSS, e agitare a 500-700 rpm per 30 min. Una volta sciolto, versare la soluzione Ficoll in un cilindro graduato da 250 ml e aggiungere HBSS a volume 130 ml sul cilindro graduato per creare una soluzione di Ficoll 25%. Coprire la parte superiore del cilindro graduato con due porzioni di Parafilm ® M (Pechiney Plastic Packaging Company, Chicago, IL) e agitare vigorosamente più volte.
  5. Per una soluzione Ficoll 23%, 20,5% e 11%, aggiungere 27,6, 24,6 e 13,2 ml di 25% Ficoll, rispettivamente, a 50 ml provette coniche. Poi, portare ogni soluzione fino a un totale di 30 ml con HBSS e agitare bene per amalgamare. Tutte e quattro le soluzioni Ficoll devono essere conservati a 4 ° C e sono buoni per un massimo di due settimane.
  6. Soluzione di collagenasi che è adatto per isolare isolotti attivi è preparato da collagenasi isolato da Clostridium histolyticum (tabella Materials). Ogni partita deve essere testato per l'efficienza enzima. Tipicamente, collagenasi viene utilizzato a 0,3-0,5 mg per ml di HBSS. Utilizzando le concentrazioni di enzimi in quella fascia (di solito 3 differenti concentrazioni), determinare la qualità e la quantità delle isole isolate da topi o fratellini per impostare la concentrazione dell'enzima di lavoro di pari età.
  7. Una volta che la corretta concentrazione viene determinata, ciascun topo richiede 35 ml di collagenasi in HBSS per l'intero protocollo di isolamento. Agitare la collagenasi in HBSS a dissolversi. Immediatamente prima della chirurgia, pre-caricare una siringa da 5 ml con la soluzione di collagenasi, posizionare la cannula e togliere le bolle d'aria, e lasciare in ghiaccio fino al momento dell'uso.
  8. I terreni di coltura isolotto per O / N incubazione è completato RPMI 1640 supporti. Per la soluzione di riserva, sciogliere un RPMI 1640 pacchetto (Gibco, New York) in 1 L di doppio H 2 O distillata e aggiungere 1,19 g HEPES (5 mm) e 2 g nacho 3 (24 mm). Regolare il pH a 7,4,filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C al buio.
  9. Per i media integrati, aggiungere il 10% FBS e 100 IU/100 mg / ml di penicillina / streptomicina, rispettivamente, lo stock RPMI 1640 supporti. Se una diversa concentrazione di glucosio è desiderato, privo di glucosio RPMI 1640 supporti possono essere usate e una determinata concentrazione di glucosio può essere aggiunto.
  10. Per uno stock di Krebs Ringer bicarbonato Buffer (Krebs), aggiungere i seguenti ingredienti per raddoppiare acqua distillata alle seguenti concentrazioni: NaCl (118,41 mm), KCl (4.69 mM), MgSO 4 (1,18 mm), KH 2 PO 4 (1.18 mM ), nacho 3 (25 mm), HEPES (5 mm), e CaCl 2 (2.52 mM) a pH 7.4. CaCl 2 deve essere aggiunto per ultimo e questa soluzione può essere conservato a 4 ° C per 2 settimane.
  11. Per fare un lavoro stock di Krebs, primo gas con 95% O 2/182 5% di CO 2 per 10-15 min con una pipetta Pasteur a 37 ° C, seguita da aggiunta di 0,5% di grado RIA BSAin volume. Successivamente, il glucosio viene aggiunto alla concentrazione desiderata per il saggio in vitro.

2. Preparazione degli strumenti

  1. Leggermente smussato le punte di 30 - e gli aghi 27 G con una pietra affilatura per arrotondare la punta acuminata. Mettere una curva a 45 gradi l'ago circa ¼ di pollice dalla punta con un paio di pinze. Fare attenzione a non stringere troppo forte, che chiudere il diametro interno dell'ago.
  2. Tagliare il filo 3/0 seta sutura in circa lunghezze da 4 pollici, una per ogni mouse.
  3. Coprire la base del microscopio dissezione con pellicola trasparente e nastro di plastica verso il basso.
  4. Tagliare alcuni pezzi di carta assorbente panchina, circa 3 x 5 pollici di dimensioni, per almeno il 2 per mouse.

3. Preparazione del mouse

  1. Riempire una siringa da 1 ml con 1 ml Avertin.
  2. Iniettare la soluzione avertin intraperitoneale a circa 40 ml / g di peso corporeo.
  3. Dopo il mouse N. Longer risponde alla coda o pizzichi piede posteriore, trasferire accuratamente alla postazione di lavoro microscopio da dissezione.
  4. Con il mouse in posizione supina e la testa rivolta distalmente, spruzzare il mouse con 70% etanolo acquoso. Accertarsi di utilizzare una adeguata quantità di etanolo al 70% per limitare la quantità di pelo nella cavità toracica esposta.

4. Apertura della Cavità toracica

  1. Pizzicare la pelliccia e pelle del topo tra le due zampe posteriori e fare un taglio iniziale attraverso l'epidermide, derma e membrana sottostante.
  2. Mentre ancora pizzicando la pelle e membrana sottostante, tagliare verso dell'arto anteriore su entrambi i lati del mouse avendo cura di evitare di tagliare eventuali organi interni.
  3. Piegare la pelle e la membrana lembo sopra la gabbia toracica e rimuovere il processo xifoideo per consentire un più facile accesso al pancreas per l'inflazione.
  4. Riorientare il mouse con la testa rivolta prossimalmente e spostare gli organi interni verso il lato destro del lavoro stzione per rivelare l'aorta discendente.
  5. A meno che il tessuto del sangue deve essere raccolto, l'aorta discendente può essere tagliato per completare euthanization. Asciugare il sangue in eccesso con carta panchina o una Kimwipe per facilitare l'accesso al dotto biliare comune.

5. Gonfiare il Pancreas

  1. Con un microscopio da dissezione, riposizionare il piccolo intestino così il dotto biliare comune forma una linea perpendicolare con la testa del mouse.
  2. Prendere una pinza e afferrare l'intestino tenue e trovare sfintere di Oddi (sfintere di ampolla) alla fine del dotto biliare comune, che strombatura affaccia tenue dal dotto biliare, formando un triangolo bianco sull'intestino rosa. Una volta che la sfintere di Oddi è stato localizzato, prendere un # 5 pinze Dumont e far scorrere la punta sotto il dotto biliare comune più vicino al piccolo intestino come possibile, facendo attenzione a non forare il condotto.
  3. Dopo aver forato attraverso l'intestino tenue e del tessuto connettivo, utilizzare lapunta del Dumont pinza per afferrare la sutura e tirarlo sotto il dotto biliare comune. Legare il dotto biliare comune più vicino alla sfintere di Oddi possibile, assicurandosi che il nodo è tesa per evitare perdite.
  4. Afferrare entrambe le estremità della sutura e tirare verso la coda per mettere qualche tensione sul dotto biliare comune. Usando una mano libera, fare una piccola incisione con le forbici micro nel dotto biliare comune appena sopra l'ultima biforcazione nel fegato. Nota: È importante non tagliare troppo vicino alla sfintere di Oddi come ciò potrebbe comportare un gonfiaggio parziale del pancreas ed evitare di tagliare attraverso il dotto biliare comune come sarà anche comportare una scarsa inflazione.
  5. Tenendo le due estremità della corda con il dotto biliare comune tesa, rimuovere la siringa / cannula che è stato pre-caricato con 5 ml di soluzione di collagenasi dal secchiello del ghiaccio, appoggiare la siringa ed inserire l'ago smussato 30 G nel taglio dotto biliare comune, facendo attenzione a non bucare il tramite del wall del condotto. Se l'ago da 30 G non è sufficientemente ampio per il dotto biliare per formare un sigillo attorno, rimuovere e sostituire con il smussate 27 ago G.
  6. Tenendo l'ago in posizione, rilasciare la sutura e prendete la siringa da 5 ml. Premere lentamente lo stantuffo della siringa. Nota: Se l'ago è stato inserito con successo nel dotto biliare comune, si espanderà.
  7. Continuare a premere il pistone lentamente e lasciando fuori in modo pulsatile fino alla prima parte del pancreas gonfia, seguita dalla pressione costante delicatamente fino pancreas gonfia più. Nota: La maggior parte pancreas tengono 3-5 ml prima di iniziare a perdere. Inoltre, una inflazione successo avrà una distribuzione uniforme del tessuto esocrino e la parte del pancreas sulla parte superiore dello stomaco sarà gonfiato.
  8. Togliere l'ago dal dotto biliare comune e partì a lato.

6. Pancreas rimozione

  1. Prendete una pinza in una mano e un paio di forbici curve inl'altra. Utilizzando le pinze, afferrare il piccolo intestino al sfintere di Oddi. Con le forbici chiuse, utilizzare la punta di una parte separata del pancreas del piccolo intestino.
  2. Stendere le forbici oltre ad allargare il divario tra il piccolo intestino e il pancreas.
  3. Posizionare la "V" delle forbici dove il piccolo intestino e pancreas fissano tra loro sul lato destro della gap appena fatta. Utilizzando la pinza tirare delicatamente l'intestino tenue passato le forbici per rimuovere il pancreas.
  4. Continuare a lavorare lungo il piccolo intestino al tessuto connettivo rosa. A questo punto, sollevare il piccolo intestino vicino dove si attacca allo stomaco e tagliare il pancreas lontano dal resto del piccolo intestino. Nota: Fare attenzione a non tagliare il pancreas come si può iniziare a sgonfiarsi.
  5. Afferrare delicatamente la parte del pancreas attaccati allo stomaco con una pinza (pinza piatta funzionano meglio). Mentre tirando delicatamente sul pancreas, usare la curvad forbici per tagliare via le connessioni tra il pancreas e lo stomaco.
  6. Individuare la milza e tenerlo con le pinze sopra il pancreas. Prendere le forbici curve e tagliare le connessioni tra la milza e il pancreas.
  7. Trovare dove il pancreas è attaccato al crasso. Raccogliete l'intestino crasso con una pinza e utilizzare la punta delle forbici per colpire attraverso. Diffondere le forbici a parte come prima per generare un divario tra l'intestino crasso e il pancreas.
  8. Reggere crasso con pinza: questo si tradurrà nel pancreas allontanamento, esponendo le sue esatte connessioni crasso. Tagliare via le connessioni rimanenti.
  9. Trova il tessuto connettivo rosa attaccato al pancreas e nell'intestino tenue e tagliare il più vicino al pancreas possibile. Nota: Se penetrante il pancreas è un problema, si consiglia di tagliare più vicino al piccolo intestino come il tessuto connettivo verrà filtrato nei passaggi successivi.
  10. Solrab tanto del pancreas possibile e sollevare delicatamente. Con forbici curve, tagliare via le rimanenti connessioni tra il pancreas e la cavità toracica per rimuovere completamente il pancreas. Nota: Il pancreas devono ancora essere gonfiati se rimosso correttamente.
  11. Conservare il pancreas rimossi in ~ 2,5 ml di soluzione di collagenasi in un tubo da 50 ml su ghiaccio fino a che tutti gli altri pancreas sono stati gonfiati e rimossi per l'esperimento.

7. Lavaggio

  1. Prendere tutte pancreas isolato e spostarli per separare 50 ml provette coniche contenenti ciascuna 25 ml di soluzione di collagenasi fresco
  2. Posizionare i tubi conici da 50 ml in posizione verticale a 37 ° C agitando bagnomaria in grado di oscillare a 220-250 giri al minuto, con lo shaker spento.
  3. Gas ciascun tubo da 50 ml con 95% O 2/5% di CO 2 per 5 minuti con una pipetta Pasteur.
  4. Richiudere ogni tubo ermeticamente e mettere di traverso in acqua agitazionebagno sotto la superficie dell'acqua. Agitare a 220-250 rpm per 20 secondi, ogni minuto, fino a 16 min a partire da 6 min. (Agitare a 6, 8, 10, 12, 14, e 16 min)
  5. Trasferire immediatamente le provette per una centrifuga a temperatura ambiente per una rotazione rapida. Portare la centrifuga fino a 1500 giri (400-500 g) e spegnere immediatamente.
  6. Utilizzando una trappola vuoto, aspirare circa 22,5 ml della soluzione di collagenasi senza disturbare il pellet. Lavare con 10 ml HBSS e vortice delicatamente per rompere il pellet.
  7. Eseguire un altro giro veloce a temperatura ambiente fino a 1.500 giri (400-500 g).
  8. Aspirare circa 10 ml di soluzione, ancora una volta senza disturbare il pellet.
  9. Lavare con altri 10 ml di ghiaccio freddo HBSS e vortice delicatamente per rompere nuovamente il pellet. Ripetere lo spin e aspirato rapide 10 ml di soluzione.
  10. Vortice delicatamente il pellet nei restanti 2,5 ml di soluzione HBSS. Versare la soluzione attraversoa 1.000 micron maglia in un nuovo tubo conico da 50 ml. Questo rimuoverà il grande frammenti di tessuto non digerito dal collagenasi.
  11. Sciacquare il vecchio tubo da 50 ml con 2,5 ml di ghiaccio freddo HBSS. Utilizzare una pipetta Pasteur per sciacquare i lati del tubo accuratamente prima di trasferire il 2,5 ml di HBSS attraverso la maglia nelle nuove tubo da 50 ml.
  12. Eseguire un altro giro veloce a temperatura ambiente a 1.500 giri (400-500 g) per far sedimentare il tessuto.
  13. Aspirare tutta la HBSS inclinando il tubo verso la trappola vuoto. Nota: E 'molto importante per non disturbare il pellet in quanto ciò comporta la perdita di isolotti. Se il pellet è allentato o inizia a muoversi verso la trappola vuoto, fermare aspirando la soluzione e ri-pellet il tessuto e poi continuare ad aspirare la soluzione rimanente.
  14. Dopo che tutti i HBSS è stato rimosso, aggiungere 4,8 ml di soluzione di Ficoll 25% e agitare per rompere il pellet.
  15. Strato attentamente 2.4 ml di 2Soluzione Ficoll 3% sulla superficie della soluzione Ficoll 25% aggiungendo la soluzione di Ficoll 23% al lato del tubo conico 50 ml. Per assicurare una stratificazione, ruotare il tubo conico da 50 ml quando si aggiunge la soluzione Ficoll.
  16. Ripetere il processo di stratificazione per il 20,5% e quindi le soluzioni Ficoll 11%. Nota: se 4 strati distinti non sono presenti, aggiungere HBSS fino alla tacca dei 50 ml e invertire il tubo 4-6 volte o fino a quando il gradiente Ficoll non esiste più. Re-pellet il tessuto e riprovare passi 7,14-7,16.
  17. Centrifugare la provetta conica da 50 ml a RT a 1.820 rpm (800 g) per 15 min.
  18. Versare tutto il Ficoll in una provetta conica da 50 ml fresco, avendo cura di lasciare il pellet di tessuto esocrino dietro. Aggiungere il ghiaccio freddo HBSS fino alla tacca dei 50 ml e capovolgere la provetta 4-6 volte per mescolare il Ficoll e HBSS insieme.
  19. Centrifugare la provetta conica da 50 ml a RT a 1.820 rpm (800 g) per 5 min.
  20. Aspirare accuratamente la maggior parte della miscela HBSS / Ficoll utilizzando un tradi vuotop. Non disturbare il pellet come è allentato e può essere aspirato facilmente.
  21. Prendere una pipetta Pasteur e trasferire il pellet in una provetta monouso cultura.

8. Picking Isolotti

  1. Aggiungere 5 ml di mezzi di raccolta (ad esempio. Completato RPMI 1640 o Krebs Ringer bicarbonato buffer) al tubo cultura usa e getta. Nota: I media raccolta variano a seconda delle applicazioni a valle.
  2. Affittare gli isolotti si depositano sul fondo della provetta di coltura per 5 min. Li Trasferire con una pipetta Pasteur a un 15 millimetri da 60 millimetri piatto di Petri in polistirolo. Nota: È importante usare una piastra di Petri in quanto questi non sono trattati e impedirà gli isolotti di aderire al piatto.
  3. In un separato 15 millimetri per 60 millimetri di polistirolo piastra di Petri, aggiungere 5 ml di topo cultura isolotto dei media (100 ml RPMI 1640 della media, 10 ml, inattivato al calore FBS, 1 ml Pen / Strep, filtro sterilizzati).
  4. Con l'aiuto di un microscopio dissezione con backligcapacità di HT, utilizzare un P-20 pipetta per raccogliere le isolette nel piatto di Petri contenente isolotto di coltura, avendo cura di evitare di trasferire i residui di tessuto acinare. Quando retroilluminato, isolotti appariranno marrone-oro e la loro membrana esterna possono brillare, mentre il tessuto acinare apparirà grigio chiaro e opaco. Se la preparazione isolotto contiene una grande quantità di detriti, si consiglia di selezionare manualmente isolotti due volte in terreno fresco. Ridurre la contaminazione detriti limiterà isolotto aggregazione dopo una notte di incubazione. Aggiunta DNAse (3.000 U / ml) al tampone di digestione può anche aiutare a limitare isolotto aggregazione (JWJ, osservazione personale). Nota: è importante contare il numero di isole isolate per pianificare esperimenti a valle.
  5. Incubare la isolotti O / N in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2.

9. CAMP Assay

  1. Etichettare 1,7 ml provette per microcentrifuga, uno per ciascun replicato del dosaggio. Nota: saggi di cAMP devono avere almeno duplicates per ogni condizione di trattamento, ma più repliche per il trattamento sono da preferire.
  2. Dopo gassing il Krebs Ringer bicarbonato tampone per 15 minuti con il 95% O 2/5% di CO 2 con la pipetta Pasteur, aggiungere lo 0,5% di BSA grado RIA e una concentrazione di glucosio finale di 1,7 mm (soluzione preincubazione). Quindi, aggiungere 1 ml di Krebs appena gasati ad ogni provetta per microcentrifuga. Due ml di Krebs è richiesto per provetta per i punti di pre-incubazione e il tempo di trattamento; comunque si consiglia di preparare almeno 5-10 ml supplementare.
  3. Agitare il isolotti al centro del piatto Petri, e utilizzando un P-20 pipetta, selezionare manualmente gli isolotti di nuovo 15 millimetri di 60 mm polistirene piastra di Petri contenente 5 ml della soluzione di preincubazione per lavare il terreno di coltura contenente glucosio dalle isolette.
  4. Il kit di analisi cAMP utilizzata è la GE Healthcare cAMP diretto BioTrak VIA. Il prococol utilizzato è una modifica di quello descritto per "meas cAMP intracellularesura utilizzando la procedura VIA non acetilazione con i reagenti di lisi romanzo, "ed è stato ottimizzato per l'uso con il numero minimo di isolotti per provetta, consentendo un aumento del numero di condizioni di trattamento e replicati tecnici. Utilizzando un P-20 pipetta di trasferimento almeno 13 isolette in ogni provetta dal punto 9.2, mantenendo la coerenza dimensione isolotto tra i tubi, con 1 ml di buffer di pre-incubazione. Nota: L'aumento del numero di repliche è più vantaggioso rispetto al numero di isolotti per provetta. Tuttavia, se ci sono abbastanza isolotti per aumentare il numero di isolotti per provetta in modo uniforme, è consigliabile farlo, fino a 25-50 isolotti per provetta.
  5. Con i tappi tubo microfuge aperto, travasare in un incubatore a 37 ° C fissato al 5% di CO 2 e incubare per 45 min a normalizzare la secrezione di insulina di tutte le isole ad un livello base.
  6. Mentre i campioni vengono incubazione preparare i trattamenti (cioè 8 mm, 11,1 mM, glucosio 16,7 mM, ecc) nel Krebs fr gasatoom punto 9.2. in 15 ml provette coniche, di 1 ml in più per tenere conto di eventuali errori di pipettaggio. Aggiungere 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) ad una concentrazione finale di 200 mM. IBMX è un inibitore della fosfodiesterasi generale che blocca la degradazione del cAMP, permettendo l'accumulo di cAMP cella che viene prodotto. (Nota:.. Questo è un vero saggio di produzione di cAMP, vedere la sezione di discussione di casi in cui la misurazione della produzione di cAMP non può essere desiderabile Se IBMX è lasciato fuori del test, più isole saranno necessari per provetta al fine di ottenere i dati di cAMP nel range lineare della curva standard).
  7. Dopo l'45 min di pre-incubazione, rimuovere i tubi microcentrifuga dal termostato, tappo e impulsi vortice ogni campione (inferiore a 0,5 sec). Questo è di mescolare il gradiente insulina che è stato probabilmente generato a causa delle isolette essere concentrati sul fondo della provetta. Bisogna fare attenzione a non vortice troppo duramente, in quanto ciò potrebbe influire negativamente sulla stabilità isolotto (Nota: Cappedtubi con isolotti possono essere delicatamente flicked o invertiti se non è possibile impulsi-vortice delicatamente. Queste opzioni si aggiunge il tempo per il test, che dovrebbe essere considerato quando si pianifica l'esperimento).
  8. Trasferire ogni tubo a una centrifuga da tavolo (RT) e girare fino a quando le isole raggiungere 10.000 giri al minuto (7,000-7500 g), e poi si spengono subito.
  9. Utilizzare una pipetta P-1000 per rimuovere la maggior parte del Krebs in ciascuna provetta da microcentrifuga, lasciando circa 10-15 ml di Krebs sul pellet isolotto. Utilizzare una pipetta P-20 per rimuovere la porzione più vicina al pellet isolotto. Se il pellet è disturbato, dispensare il Krebs nel tubo e re-spin.
    (Nota: se lo sperimentatore trova troppo difficile rimuovere tutti i Krebs dal pellet isolotto senza disturbarla, l'ultimo 10-15 microlitri può essere lasciato acceso e contabilizzata nel volume totale tardi nel protocollo.
  10. Ottenere una adeguata quantità di azoto liquido in un contenitore isolato di scattare congelare i campioni dopo incubazione.
  11. Prendete i campioni fuori dell'incubatore, berretto, vortice rapidamente (meno di 0,5 sec) girare i tubi microcentrifuga in una centrifuga da tavolo (RT) fino a 10.000 rpm (7,000-7500 g), e poi spento immediatamente. Se insulina o di un altro metabolita è un'applicazione a valle desiderata, utilizzare una pipetta P-1000 per raccogliere una aliquota di mezzo in una provetta per microcentrifuga e conservare a -20 ° C fino ad ulteriore analisi. Se supporti stimolazione non vengono raccolti, può essere scartato.
    (Nota: IBMX è un forte potenziatore della secrezione di insulina glucosio-stimolata (GSIS) Pertanto, i risultati ottenuti da GSIS cAMP mezzo di stimolazione possono non rappresentare accuratamente il vero effetto di trattamenti specifici su GSIS, soprattutto se questi effetti sono sottili.).
  12. Ripetere passo 9.9 per rimuovere quanto più mezzo di stimolazione possibile senza disturbare il pellet isolotto. Snap congelare il pellet isolotto in azoto liquido una volta che ci si trova a meno di 10-15 ml di Krebs lasciato sul pellet isolotto. Una volta che tutte lecampioni sono stati congelati a scatto, conservare a -80 ° C fino misurazione cAMP.
  13. Il giorno della determinazione cAMP, preparare i reagenti di lisi nuovi secondo il protocollo dei produttori. Aggiungere 200 ml di reagente di lisi 1B per ciascuna provetta da microcentrifuga e vortex alla massima velocità per 30 sec. Lasciate che i tubi si siedono in ghiaccio per 10 minuti, vortex ogni 2 min 30 sec. (Nota: Il protocollo raccomanda di effettuare un'analisi microscopica con trypan blu per garantire la lisi cellulare, ma questo non è eseguita per le isole).
  14. Preparare gli standard di lavoro e impostare la micropiastra EIA esattamente come descritto nel protocollo del produttore. Dopo che il substrato enzimatico è stato incubato con la micropiastra per 30 minuti, eseguire la fase facoltativa 1.0 M di acido solforico, e determinare l'assorbanza dei pozzetti a 450 nm usando un lettore di micropiastre.
  15. Risultati AMP ciclico saranno registrati come fmol / pozzetto. Questo dovrebbe essere normalizzato al volume totale del campione originale (200 microlitri + qualsiasiKrebs residuo lasciato sulle isolette dal punto 9.9). Successivamente, i risultati possono sia essere normalizzati per il numero totale di isolotti, dando fmol cAMP prodotto / isolotto, o campioni lisato può essere sottoposto ad acido bicinconinico saggio (BCA) proteina per normalizzare i risultati di proteina cellulare totale (dando proteina fmol / mg) . Quest'ultimo è consigliato quando le dimensioni delle isole sono incoerenti tra i campioni, e può essere un surrogato per le dimensioni delle isole. Il kit di analisi delle proteine ​​Pierce BCA è stato utilizzato con successo in questo protocollo, e richiede solo 25 ml di campione. Gli standard BSA devono essere preparati in lisi reagente 1B dal kit di analisi cAMP.

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Risultati

Per garantire un alto rendimento isolotto durante l'isolamento, tecniche chirurgiche descritte nel protocollo devono essere seguiti attentamente. Sebbene le tecniche qui presentate saranno su misura per ogni laboratorio, ci sono alcuni passaggi critici che porterà ad un isolamento di successo. Al fine di rendere il dotto biliare comune facilmente accessibile, si raccomanda che gli organi spostati a destra del mouse (Figura 1). Inoltre, questo permetterà il pancreas a gonfiare con una quantità inferi...

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Discussione

Con la prevalenza di diabete proiettate a pregiudicare il 7,7% della popolazione mondiale, l'esigenza di nuove tecniche di ricerca è fondamentale sia per capire e curare il diabete 18. L'attuale isolamento delle isole è un protocollo ben consolidata utilizzati per la sperimentazione in vitro ed è stato presentato in precedenza con lievi modifiche 11,14,16. Anche se la secrezione di insulina è un'applicazione a valle comune di isole isolate, concentrandosi su componenti a monte,...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare Renee L. Pasker e Harpreet K. Brar per l'assistenza tecnica di esperti sui protocolli descritti in questo lavoro. Inoltre, vorremmo riconoscere il mentoring di Christopher B. Newgard alla Duke University e Alan D. Attie presso l'Università del Wisconsin-Madison, con il supporto dei loro membri di laboratorio, che ci ha permesso il tempo e il supporto necessario per ottimizzare l' protocolli descritti. In particolare, ringraziamo Hans HOHMEIER, Danhong Lu, e Helena Winfield nel Laboratorio Newgard e Maria Rabaglia nel Laboratorio Attie per le discussioni produttive e consigli. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH DK080845 sovvenzione e Juvenile Diabetes 594
Research Foundation concessione 17-2011-608 (a MEK)

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Collagenasi da Clostridium histolyticum adatto per isolare isole attiveSigma-AldrichC7657
Ficoll 400Sigma-AldrichF9378
Hanks Soluzione salina bilanciata 10XInvitrogen (Gibco)14065-056
HEPESSigma-AldrichH3375
RPMI 1640 (polvere)Invitrogen (Gibco)31800-022
Albumina da siero bovino (BSA)Sigma-AldrichA7888
3/0 Filo di sutura di setaStrumenti per la scienza fine18020-30
Dumont #5 Pinzescienza fine11251-10
0,8 mm Pincipe   Fine Science Tools11050-10
Forbici curveFine Science Tools14061-10
Vannas-Tü Forbici a molla bingen - Dritte/affilate/8,5 cm/5 mm TaglienteFine Science Tools15003-08
Forbici da dissezioneFine Science Tools14002-14
Siringa BD Luer-Lok da 5 mlBD309646
30 G Ago BD 1/2" LunghezzaBD305106
27 G Ago BD 1/2" LunghezzaBD305109
Pietra per affilareStrumenti di scienza fine29008-01
2-2-2-tribromoetanoloSigma-AldrichT48402-25G
2-metil-2-butanoloSigma-Aldrich240486-100mL
Cloruro di sodio (NaCl)Sigma-AldrichS9888
Cloruro di potassioSigma-AldrichP3911
Fosfato monopotassico (KH2PO4)Sigma-AldrichP0662
Bicarbonato di sodio (NaCHO3)Sigma-AldrichS6014
CaCl2· 2H2OSigma-AldrichC3881
MgSO4· 7H2OSigma-AldrichM9397
Penicillina-StreptomicinaInvitrogen (Gibco)15140-122
Siero fetale bovino inattivato termicamente (HI FBS)Fisher ScientificSH30088.03HI
3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX)Sigma-Aldrich5879-100MG
per la Siringa BD da 1 ml BD 309628

Riferimenti

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