Saggio funzione in vitro β-cellulare utilizzando isolate del mouse isole di Langerhans è una componente importante nello studio della fisiopatologia del diabete e terapeutica. Mentre molte applicazioni a valle sono disponibili, questo protocollo descrive specificamente la misurazione di intracellulare adenosina monofosfato ciclico (cAMP) come parametro essenziale determinare la funzione β-cellulare.
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Articolo metodologico
Un metodo per l'isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
La glicemia incontrollata è una caratteristica del diabete mellito e promuove patologie come la neuropatia, nefropatia e retinopatia. Con la crescente prevalenza del diabete, sia immuno-mediata di tipo 1 e obesità legati tipo 2, gli studi volti a delineare fisiopatologia del diabete e dei meccanismi terapeutici sono di importanza critica. I β-cellule delle isole pancreatiche di Langerhans sono responsabili opportunamente secrezione di insulina in risposta a concentrazioni di glucosio nel sangue. Oltre al glucosio e altri nutrienti, i β-cellule sono stimolate dagli ormoni specifici, incretins, che sono secreti dall'intestino in risposta ai pasti e agire sui recettori β-cellule che aumentano la produzione intracellulare di adenosina monofosfato ciclico (definito cAMP). Diminuzione della funzione β-cellulare, massa, e la reattività incretine sono ben compresi, per contribuire alla fisiopatologia del diabete di tipo 2, e sono anche sempre più collegate with diabete di tipo 1. L'attuale topo isolamento delle isole e il protocollo determinazione cAMP possono essere uno strumento per aiutare a delineare i meccanismi che promuovono la progressione della malattia e gli interventi terapeutici, in particolare quelli che sono mediate dai recettori incretine o recettori che agiscono attraverso la modulazione della produzione di cAMP intracellulare legato. Mentre saranno descritte soltanto misurazioni cAMP, il protocollo di isolamento isolotto descritto crea un preparato pulito che consente anche per molte altre applicazioni a valle, come il glucosio stimolata la secrezione di insulina, [3 H]-timidina, proteine abbondanza, e l'espressione di mRNA.
Introduzione
La rigorosa manutenzione di euglicemia è indispensabile per evitare morbosità come la neuropatia, nefropatia e retinopatia, che sono tutte caratteristiche della patologia di incontrollata di tipo 1 e 2 il diabete 1. Funzione β-cellulare ridotto e di massa sia di tipo 1 e diabete 2 perturbano le concentrazioni di glucosio nel sangue 2. Considerando che tipo immuno-mediata 1 diabete risultati da una perdita devastante di β-cellule che producono insulina, alterata secrezione di insulina β-cellulare e la segnalazione periferica all'insulina nel diabete di tipo 2 insieme promuovono iperglicemia, dislipidemia, e aumento della produzione epatica di....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità a tutte le linee guida, regolamenti e agenzie di regolamentazione. Il protocollo ha dimostrato di essere stata eseguita sotto la guida e l'approvazione della cura degli animali e uso Comitato Istituzionale (IACUC) della University of Wisconsin-Madison.
1. Preparazione di soluzioni
- Il metodo di eutanasia in questo protocollo è dissanguamento sotto anestesia Avertin (per una rassegna delle alternative, vedi la discussione). Per rendere Avertin, aggiungere 0,625 g (1,25% o 44,2 mM) di 2-2-2 tribromoethanol a 1,25 ml di 2-metil-2-butanolo in un tubo da 15 ml ....
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Risultati
Per garantire un alto rendimento isolotto durante l'isolamento, tecniche chirurgiche descritte nel protocollo devono essere seguiti attentamente. Sebbene le tecniche qui presentate saranno su misura per ogni laboratorio, ci sono alcuni passaggi critici che porterà ad un isolamento di successo. Al fine di rendere il dotto biliare comune facilmente accessibile, si raccomanda che gli organi spostati a destra del mouse (Figura 1). Inoltre, questo permetterà il pancreas a gonfiare con una quantità inferi.......
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Discussione
Con la prevalenza di diabete proiettate a pregiudicare il 7,7% della popolazione mondiale, l'esigenza di nuove tecniche di ricerca è fondamentale sia per capire e curare il diabete 18. L'attuale isolamento delle isole è un protocollo ben consolidata utilizzati per la sperimentazione in vitro ed è stato presentato in precedenza con lievi modifiche 11,14,16. Anche se la secrezione di insulina è un'applicazione a valle comune di isole isolate, concentrandosi su componenti a monte,.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Renee L. Pasker e Harpreet K. Brar per l'assistenza tecnica di esperti sui protocolli descritti in questo lavoro. Inoltre, vorremmo riconoscere il mentoring di Christopher B. Newgard alla Duke University e Alan D. Attie presso l'Università del Wisconsin-Madison, con il supporto dei loro membri di laboratorio, che ci ha permesso il tempo e il supporto necessario per ottimizzare l' protocolli descritti. In particolare, ringraziamo Hans HOHMEIER, Danhong Lu, e Helena Winfield nel Laboratorio Newgard e Maria Rabaglia nel Laboratorio Attie per le discussioni produttive e consigli. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH DK080845 sovvenzione....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Collagenasi da Clostridium histolyticum adatto per isolare isole attive | Sigma-Aldrich | C7657 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Hanks Soluzione salina bilanciata 10X | Invitrogen (Gibco) | 14065-056 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| RPMI 1640 (polvere) | Invitrogen (Gibco) | 31800-022 | |
| Albumina da siero bovino (BSA) | Sigma-Aldrich | A7888 | |
| 3/0 Filo di sutura di seta | Strumenti per la scienza fine | 18020-30 | |
| Dumont #5 Pinze | scienza fine | 11251-10 | |
| 0,8 mm Pincipe | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Forbici curve | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Vannas-Tü Forbici a molla bingen - Dritte/affilate/8,5 cm/5 mm Tagliente | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Forbici da dissezione | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Siringa BD Luer-Lok da 5 ml | BD | 309646 | |
| 30 G Ago BD 1/2" Lunghezza | BD | 305106 | |
| 27 G Ago BD 1/2" Lunghezza | BD | 305109 | |
| Pietra per affilare | Strumenti di scienza fine | 29008-01 | |
| 2-2-2-tribromoetanolo | Sigma-Aldrich | T48402-25G | |
| 2-metil-2-butanolo | Sigma-Aldrich | 240486-100mL | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Cloruro di potassio | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Fosfato monopotassico (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Bicarbonato di sodio (NaCHO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| CaCl2· 2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| MgSO4· 7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Penicillina-Streptomicina | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
| Siero fetale bovino inattivato termicamente (HI FBS) | Fisher Scientific | SH30088.03HI | |
| 3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX) | Sigma-Aldrich | 5879-100MG |
Riferimenti
- Cryer, P. E. Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes. Diabetologia. 45, 937-948 (2002).
- Alberti, K. G., Zimmet, P. Z.
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Ristampe e permessi
