Analisi trascrittomica di campioni chirurgici retiniche umane Utilizzo ufficiale

Summary

Abbiamo utilizzato campioni di retina da retinectomy per un'analisi trascrittomica di distacco di retina. Abbiamo sviluppato una procedura che consente la conservazione di RNA tra i blocchi chirurgici e il laboratorio. Abbiamo standardizzato un protocollo per purificare l'RNA da cesio ultracentrifugazione cloruro di assicurare che gli RNA purificati sono adatti per l'analisi di microarray.

Abstract

Distacco di retina (RD) descrive una separazione della retina neurosensoriale dalla epitelio pigmentato retinico (RPE). La RPE è essenziale per la normale funzione dei neuroni sensibili alla luce, i fotorecettori. Distacco della retina dal RPE crea un gap fisico che è pieno di fluido extracellulare. RD avvia eventi avversi cellulari e molecolari che influenzano sia la retina neurosensoriale e la RPE in quanto lo scambio fisiologico di ioni e metaboliti è gravemente perturbato. La conseguenza per la visione è legata alla durata del distacco poiché una rapida reapposition dei due tessuti determina il ripristino della visione ^1. Il trattamento della RD è esclusivamente chirurgica. Rimozione del gel vitreale (vitrectomia) è seguita dalla rimozione non parte essenziale della retina intorno alla zona distaccata per favorire il distacco di retina. Gli esemplari della retina rimosse sono res nullius (nulla) e di conseguenza normalmente scartati.Per recuperare RNA da questi campioni chirurgici, abbiamo sviluppato la procedura ufficiale che permette di RNA conservazione durante il trasferimento dal blocco chirurgico al laboratorio. Abbiamo anche un protocollo standardizzato per purificare l'RNA da cesio ultracentrifugazione cloruro di assicurare che gli RNA purificati sono adatti per l'analisi globale dell'espressione genica. La qualità del RNA è stato convalidato sia mediante RT-PCR e microarray. L'analisi dei dati mostra un coinvolgimento simultaneo di infiammazione e la degenerazione dei fotorecettori durante RD.

Introduction

Il principale obiettivo terapeutico nel distacco di retina (RD) è di trovare un modo per limitare i danni fotorecettori retinici e infiammazione risultante dalla separazione dei fotorecettori dalle cellule epiteliali pigmentate retiniche. Durante RD, vengono attivati ​​cellule RPE, migrare, dedifferentiate, e proliferano sulla superficie della retina distaccata, esercitando forze contrattili conducono a complicazioni. Analisi trascrittomica di RD è un modo per identificare i geni bersaglio con l'espressione modificata a seguito di RD e quindi futuri molecole terapeutiche che potrebbero migliorare il risultato visivo finale in combinazione con la chirurgia. E '....

Protocol

1. Giornale: procedimento di recupero degli esemplari del blocco chirurgico

Nel laboratorio

1. Ottenere un contratto di importazione dalla società di trasporto espresso.
2. Riempire 10 (o 25) le forme di trasporto, con l'indirizzo postale del laboratorio che indica la persona da contattare in laboratorio (numero di telefono e indirizzo email).
3. Preparare 10 (o 25) le forme esemplari numerati da 1 a 10 (o 25). Queste forme includono spazi dedicati ad informare su: a) l'identificazione anonima del paziente, b) la data della chirurgia e c) le eventuali osservazioni aggiuntive che il chirurgo vorrebbe aggiungere. ....

Results

La procedura ufficiale (figura 1) permette a recuperare esemplari di retina dal blocco chirurgico di RNA purificato, e di analizzare il trascrittoma di distacco di retina. Risultati distacco di retina in up-regulation del chemiotattica dei monociti MCP1 gene CCL2, e nella diminuzione della espressione del fotorecettore asta di trasduzione genica GNAT1, l'onda corta cono opsina OPN1SW, e la homeogene CRX (Figura 2). L'induzione di CCL2 è deriv.......

Discussion

Lo sviluppo di una procedura di recupero tessuto dal blocco chirurgico è stato essenziale per l'analisi del trascrittoma di distacco di retina. Si dovrebbe notare che questo tipo di intervento viene praticato in emergenza e che il oculisti operativo hanno poco tempo per partecipare a un programma di ricerca biologica in cui esse operano. Questo retinectomy viene anche eseguito stocasticamente in ogni servizio, in modo che il modo più facile raggiungere numeri statistici è di lavorare con una rete. In tale rete, la s.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuga	Beckman Coulter	Aventi J-E
Rotore	Beckman Coulter	JS-5.3
Ultracentrifuga	Beckman Coulter	LE 80K
Rotore	Beckman Coulter	SW41
Alimentatore	Biorad	Pac 3000
PolytronTM	Kinematica	PT 2100	in dotazione con PT-DA 2105:2
Dispositivo per elettroforesi su gel di agarosio	Biorad	MiniGel Cell GT
Biorad			Biorad GelDoc-It Provetta
sterile in polietilene da 5 ml	Greiner	115261
Provetta sterile per centrifuga in poliallomero	Beckman Coulter	331372
Reagenti chimici	Sigma		Grado di biologia molecolare (prodotti privi di RNasi e DNasi)
Soluzione di pulizia	VWR	RBS
Chip microarray	Affymetrix	Human U133 plus 2 array