Quantitative Analysis multispettrali Dopo tessuto fluorescente Trapianto per la visualizzazione delle origini cellulari, tipi e interazioni

Summary

Masse di tessuto complesse, da organi di tumori, sono composti da vari elementi cellulari. Abbiamo chiarito il contributo di fenotipi cellulari all'interno di un tessuto utilizzando multi-etichettati topi transgenici fluorescenti in combinazione con multiparametrica immunofluorescenza seguita da unmixing spettrale di decifrare origine cellulare e caratteristiche cellulari basati su espressione della proteina.

Abstract

Con il desiderio di comprendere contributi di molteplici elementi cellulari allo sviluppo di un tessuto complesso, come i numerosi tipi di cellule che partecipano rigenerazione tissutale, formazione di tumori, o vasculogenesi, abbiamo ideato un multicolore modello trapianto cellulare di sviluppo del tumore in che le popolazioni di cellule provengono da diversi colori giornalista topi del gene modo fluorescente e vengono trapiantate, innestate o iniettati dentro e intorno un tumore in via di sviluppo. Queste cellule colorate vengono poi reclutati e inseriti nel stroma tumorale. Al fine di valutare quantitativamente midollo osseo derivate cellule stromali del tumore, abbiamo trapiantato GFP che esprimono tutta transgenica midollo osseo in RFP letale irraggiato esprimere topi come approvato dalla IACUC. 0ovarian tumori che sono stati ortotopicamente iniettato nei topi trapiantati sono stati asportati 6-8 settimane dopo l'attecchimento e analizzati per marcatore midollo osseo di origine (GFP) e marcatori anticorpali per rilevare tumore associatostroma utilizzando tecniche di imaging multispettrale. Abbiamo poi adattato una metodologia che chiamiamo MIMicc-multispettrale Interrogatorio di composizioni cellulari multiplex, utilizzando unmixing multispettrale di fluoroprobes per valutare quantitativamente cui etichettato cellule venuto da cui le popolazioni a partire (in base giornalista originali etichette geni), e la nostra capacità di unmix 4, 5 , 6 o più spettri per aumenti di diapositive, abbiamo aggiunto immunoistochimica aggiuntivi associati a linee cellulari o differenziazione per aumentare la precisione. Utilizzando il software di rilevare i segnali multiplex fluorescente co-localizzate, le popolazioni stromali tumorali possono essere rintracciati, annotate e caratterizzate sulla base di marcatore colorazione. ¹

Introduction

Comprendere lo sviluppo dei tessuti e la riparazione è significativo per chiarire che partecipano componenti cellulari nella guarigione delle ferite, ^2,3 medicina rigenerativa, biologia dello sviluppo e biologia del tumore. In circostanze di riparazione, numerosi tipi di cellule infiltrano il microambiente circostante per aiutare nella vascolarizzazione, ECM deposizione, la proliferazione e la ristrutturazione dei tessuti. Fattori cellulari e fenotipi possono essere identificati sulla base di multiparametrico, marcatori multiplex che possono identificare la localizzazione, stato di differenziazione e l'interazione tra componenti cellulari all'interno del microambiente indagato. Qui, descriviamo lo sviluppo del tumore come un esempio tipico di questo modello di trapianto multicolor-multicellulare seguita da immagini multispettrali e la metodologia unmixing spettrale.

Progressione tumorale è un processo a più fasi che è segnata da diverse funzionalità acquisite che includono una maggiore proliferazione, unproprietà ntiapoptotic, invasive e angiogenici. ^4, dello sviluppo tumorale è facilitata da cellule non neoplastiche che vengono reclutate nell'ambiente circostante per fornire fattori di crescita, matrici strutturali, reti vascolari e modulazione immunitaria. ^1,5,6 Questo microhabitat consiste di cellule derivate da , i tessuti locali vicini come adiposo e vasi sanguigni e fonti lontane come il midollo osseo cellule derivate ^1. Il grado di incorporazione di cellule non neoplastiche dipende dalla richiesta dal tumore, che spesso corrisponde con la fase / grado del tumore. Per comprendere il ruolo del microambiente tumorale solidale, si deve capire l'origine e il potenziale di differenziazione delle popolazioni di cellule non neoplastiche.

Questo protocollo è stato progettato per favorire l'interpretazione della progressione tumorale attraverso la visualizzazione sia dei componenti cellulari derivate midollo osseo, e la deriv tessuto localecellule ed. Utilizzando fluorescenti giornalista-gene che esprime topi transgenici, abbiamo trapiantato GFP (proteina verde fluorescente) del midollo osseo in una RFP letale irradiato (proteina rosso fluorescente) del mouse. Dopo il successo attecchimento del midollo osseo, una linea di cellule tumorali singenico viene iniettato ortotopicamente e ha permesso di attecchire per 4-8 settimane. Il tumore risultante viene asportato dal mouse e trattati per immunofluorescenza (IF) colorazione di visualizzare i componenti stromali. Multiplexing IF marcatori è una tecnica comunemente usata che prevede una significativa ottimizzazione ^7-9, ma utilizzando una piattaforma di imaging / unmixing multispettrale migliora il potenziale di combinazioni di marcatori fluorescenti che possiedono sovrapposizione spettrale. Qui vi presentiamo una tecnica che chiamiamo interrogatorio MIMicc-multispettrale di composizioni cellulari multiplexati a macchiare e analizzare fino a otto marcatori all'interno di una sezione di tumore su una singola diapositiva, al fine di analizzare le origini cellulare, differenziamento cellulare strecchi e le interazioni cellula-cellula delle parti entro il microambiente tumorale. Questo esempio semplificato ha il potenziale per essere ampliato su per analizzare cinque, sei o più marker utilizzando anticorpi o di espressione fluorescente intracellulare promotore-driven. Tabella 1 elenca i potenziali combinazioni di anticorpi fluorescenti colorazione con specie adatte presi in considerazione.

Protocol

Singenico Murino trapianto di midollo osseo (BMT), come approvato dai protocolli istituzionali IACUC (Nota: Il successo di questo protocollo richiede l'utilizzo di qualsiasi tipo di cellula marcata (s) come destinazione per l'analisi multispettrale, e per facilitare l'analisi a valle, si può sfruttare qualsiasi genetica o etichettatura cellulare stabile. Suggeriamo che ogni cellula, tessuto o organo-a-essere può essere applicato a un modello di trapianto e che il trapianto può contenere molte popolazioni etichettati unici come la ricerca ritenga utile. Inoltre, multi-marcato sistemi cellulari , come quelli trovati in topi transgenici contenenti lignaggio più ristretta fluorescente popolazioni, possono essere progettati per eliminare le complicazioni del trapianto per lo studio di alcuni stati patologici.

1. Mortalmente irradiare BMT topi riceventi con una singola dose di 9,5 Gy quattro ore prima di ricostituzione con l'osso del donatore di midollo. (Destinatari BMT GFP dovrebbero essere 6-10 settimane di età).
2. Bagnare la pelliccia del mouse con il 70% di etanolo prima del clipping e peeling indietro per esporre gli arti posteriori con le forbici chirurgiche sterili. Rimuovere tutta la gamba compresa la cresta iliaca al sacroiliaca. Eliminare il piede tagliando appena sopra la caviglia e quindi rimuovere completamente tutto muscoli, legamenti e il tessuto in eccesso dal tessuto osseo. Osseo filo dalla tibia, fibia e cresta iliaca con un ago 23 G utilizzando 2% FBS in PBS sterile (PBS-2). (Donatori RFP BMT dovrebbero essere sacrificati in base alle norme istituzionali.)
3. Fetta e delicatamente schiacciare l'osso residuo in frammenti utilizzando un bisturi e pinza e poi posto in tubo da 50 ml con 3 mg / ml di collagenasi I per 1 ora a 37 ° C a 300 rpm.
4. Top fuori il tubo con PBS-2 e raccogliere il surnatante in una nuova provetta e si combinano con le cellule arrossate. Spin down a 250rpm per 5 minuti a 4 ° C.
5. Risospendere le cellule in PBS-2 e filtrare attraverso filtro a 40 nm cellulare. A questo punto, le cellule possono essere etichettati per fluorescenT attivate cella (FACS) se si vuole manipolare popolazioni specifiche per il BMT.
6. Risospendere 2 x 10 ⁶ cellule per 100 microlitri di PBS, per topo. Utilizzare 29 G ago per iniettare sistemica in irradiati topi riceventi GFP da coda o retro-orbitale vena-conica-side-up. Iniettare un mouse con 100 microlitri di PBS solo come controllo di attecchimento. Usare una lampada di calore per dilatare i vasi prima dell'iniezione e utilizzare un sistema di ritenuta iniezione coda vena dopo l'iniezione. Avere garza sterile a disposizione per applicare una leggera pressione per l'iniezione palo coda.
7. Tre settimane dopo BMT, raccolgono retro-orbitale sangue e analizzare mediante citometria a flusso per confermare la presenza di cellule circolanti GFP e l'assenza di cellule circolanti RFP. Il mouse di controllo sarà morto, a questo punto.

2. Tumore Engraftment Secondo Istituzionali Linee guida IACUC

1. Crescere ID8 ovariche cellule tumorali murine in vitro prima in vivo di iniezione (1 x 10 ⁶ cells per mouse). Giorno dell'iniezione, Trypsinize cellule, lavare con PBS e risospendere in PBS a 1 x 10 ⁶ cellule per 100 microlitri.
2. Iniettare cellule tumorali nella cavità intaperitoneal del mouse, ago deve essere smussatura-side-up. Sterilizzare vista l'iniezione con il 70% di etanolo. Iniettare in basso a sinistra o quadrante inferiore destro dell'addome (craniale e mediale leggermente al set inferiore di capezzoli addominali di topo femmina), evitare di colpire gli organi. Trattenere il mouse afferrando per la collottola e tenendo la coda con il mignolo o l'anello dito. I topi possono essere anestetizzati con isoflurano per questa procedura.
3. Sacrifica i topi quando i segni di tumore attecchimento, come il leggero gonfiore addominale, sono evidenti. Questo si verificherà oltre 4-12 settimane.
4. I tumori Accise dalla cavità IP. Tumori all'interno della cavità sarà simile a noduli bianchi su e intorno alla superficie degli organi. Con un bisturi, rimuovere tumori e porre in un tubo / barattolo di formalina al 10% per 24 ore fissaggio. Istologica pil risarcimento può essere demandate a nucleo patologia / istologia se i reagenti e materiali non sono prontamente disponibili per paraffina e preparazione del vetrino. Tessuto sezione in 5-8 micron fette su vetrini per le successive procedure di colorazione.

3. Multi-parametro immunofluorescenza

1. Preparare vetrini di controllo unico colore per ogni sonda fluorescente utilizzato nell'esperimento. In questo scenario, vengono utilizzati quattro colori. Pertanto, quattro slitte per ogni singolo colore e anche uno scivolo per il controllo del rumore di fondo e infine uno scivolo per la colorazione completa combinazione. (Totale vetrini = 6) Tutti i vetrini saranno trattati fianco a fianco in modo identico per minimizzare variazione sperimentale.
2. Cuocere sezioni di paraffina a 56 ° C per 1 ora.
3. Lavare i vetrini 3x 10 min in xilene.
4. Lavare 2x 5 min al 100% di etanolo.
5. Lavare 1x 3 min 95% di etanolo
6. Lavare 1x 2 min90% di etanolo.
7. Lavare 1x 2 min70% di etanolo.
8. Wash 1x 2 min in acqua. Lentamente immergere il rack per colorazione in e fuori 10x acqua.
9. Durante l'ultima serie di lavaggio, pre-bollire tampone di citrato di sodio per 2 minuti (forno a microonde in alto). (Può sostituire con tampone tris-EDTA seconda delle condizioni anticorpi in uso)
10. Lessare i vetrini per 20 min in tampone sodio citrato (microonde a potenza 10% o in pentola a pressione). Se il buffer di bolle, spegnete forno a microonde e lasciate riposare.
11. Rimuovere dalla fonte di calore e lasciare le diapositive riposare per 30 min in tampone citrato di sodio raffreddare.
12. Sciacquare i vetrini in acqua per 5 minuti.
13. Mark intorno sezioni tumorali con Pap Pen e mettere 2% BSA / 1% FBS acido maleico tampone bloccante per 1 ora. Preparare i vetrini singolarmente per non farli asciugare durante questa fase.
14. Preparare gli anticorpi primari diluizione ottimale in tampone di bloccaggio. (Se gli anticorpi in uso sono tutti di specie differenti (o IgG catena variazione-ex: IgG1 vs IgG2a della stessa specie) possono essere usati in combinazione come duranteingle periodo di incubazione. Se le specie anticorpali sovrappongono, poi incubazioni devono essere eseguite sequenzialmente per minimizzare anticorpi cross-reazione.)
15. A questo punto, lasciare due diapositive con bloccaggio solo buffer. Questi due scivoli serviranno come controllo senza macchia e controllo macchia nucleare. Gli altri controlli singoli colori verranno incubate con anticorpi primari individuali. Solo la diapositiva analisi avrà una combinazione di anticorpi primari.
16. Incubare con anticorpo primario in una scatola della camera umidità sulla lenta rotazione shaker overnight a 4 ° (~ 16-20 hr) (Nota: quando si lavora con 4 + fluorofori, colorazione sequenziale o coniugazione diretta può essere necessario minimizzare anticorpi cross-reazione . In queste circostanze, ripetere i passaggi 1,16-1,21 finché tutti gli anticorpi vengono applicati ai vetrini.)
17. Lavare i vetrini per 10 min in PBST (2x) delicatamente shaker
18. Mentre lavaggio sta andando, preparare AlexaFluor 488, 594 e 647 anticorpi secondari per una diluizione finaledi 1:1000 in tampone di bloccaggio. (Assicurarsi che questi anticorpi e diluizioni sono conservati a 4 ° C e al buio in ogni momento a preservare fluorescenza tra i lotti e nel tempo.)
19. Sui vetrini singoli controllo del colore, posizionare singoli diluizioni AlexaFluor corrispondenti alle specie di anticorpo primario utilizzato. Tutti gli anticorpi secondari saranno collocati sul vetrino analisi. I vetrini di controllo non colorati e il nucleare macchiati rimarranno con tampone di arresto nel corso di questo passo.
20. Incubare in una scatola della camera di umidità (coperto con un foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce) sulla lenta agitatore rotante a temperatura ambiente per 2 ore.
21. Lavare i vetrini per 5 min in PBST (2x) delicatamente shaker. Coprire con un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce.
22. Aggiungi DAPI (1:10.000) per 1 min alla diapositiva solo DAPI e la diapositiva di analisi. Coprire con un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce. Gli altri vetrini possono essere lasciati coperto in contenitori di lavaggio.
23. Lavare le due DAPI incubatevetrini in un contenitore separato per i primi 5 minuti di lavaggio, per non contaminare le altre diapositive con macchia DAPI. Per il secondo 5 min di lavaggio, le diapositive possono essere combinati in PBST (tutti i lavaggi dovrebbero essere condotti su un agitatore). Coprire con un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce.
24. Diapositive breve tuffo in acqua prima copertura di scivolare (1,5 di spessore con mezzo di montaggio acquoso di preservare fluorescenza)
25. Lasciate asciugare 3 ore al buio a temperatura ambiente.
26. Sigillare i bordi del vetrino con unghie indurente. (Non usare lo smalto come acetone può placare il segnale fluorescente).
27. Analizzare i vetrini immediatamente o conservare a 4 ° C per le analisi future.

4. Imaging multispettrale

1. Raccogliere immagini multispettrali, utilizzando una macchina fotografica Nuance EX (contenente un filtro accordabile a cristalli liquidi) su una Olympus X-63 microscopio verticale con il software di Nuance per la raccolta dati.
2. Raccogliere le immagini utilizzando un obiettivo olio per aumentare la risoluzione.
3. Initial impianto include fissare la gamma spettrale per ciascun fluoroforo in uso.
   1. Per 4 colori:
      1. DAPI: 420-480nm
      2. AF488: 490-580nm
      3. AF594: 590-640nm
      4. AF647: 650-720nm
4. Prendere una immagine iniziale della diapositiva analisi per ottenere i tempi di esposizione adeguati per ciascuno degli intervalli spettrali.
5. Creare "libreria spettrale" che il software utilizzerà per identificare e separare il rapporto segnale-rumore dei fluorofori uno dall'altro e segnale di fondo. (Nota: Ogni fluorocromo deve avere la propria singola diapositiva controllo del colore per assemblare una libreria spettrale con relative curve di lunghezza d'onda per assicurare la corretta analisi dei set di dati Esempio: 3 fluorofori = 4 vetrini di controllo; 5 fluorofori = 6 vetrini di controllo.).
   1. Immagine diapositiva senza macchia prima. Questa diapositiva sarà designato all'interno del coll spettraley come sfondo.>
   2. Immagine del DAPI solo far scorrere secondo. Questa diapositiva verrà utilizzato per designare i nuclei DAPI-macchiate con il tool "disegnare" e sarà salvato all'interno della libreria spettrale come DAPI.>
   3. Immagine La diapositiva terzo AF488-only. Questa diapositiva verrà utilizzato per designare le regioni AF488-colorati con lo strumento "disegnare" e sarà salvato all'interno della libreria spettrale come AF488.>
   4. Immagine l'AF594 solo scivolare al quarto posto. Questa diapositiva verrà utilizzato per designare le regioni AF594-colorati con lo strumento "disegnare" e sarà salvato all'interno della libreria spettrale come AF594.>
   5. Immagine l'AF647 solo far scorrere quinto. Questa diapositiva verrà utilizzato per designare le regioni AF647-colorati con lo strumento "disegnare" e sarà salvato all'interno della libreria spettrale come AF647.>
   6. A seguito della raccolta di ciascun componente spettrale individuo,salvare la libreria spettrale e il protocollo.>
6. Una volta che la libreria spettrale è completa, trovare regioni di interesse sul vetrino sul microscopio analisi e raccogliere / salvare le immagini.>

5. Analisi quantitativa di immagini multispettrali

1. Importare un assortimento rappresentativo di immagini acquisite utilizzando Nuance InForm Software.
2. Aprire la libreria spettrale salvato come indicato dal programma
3. Identificare le regioni di tessuto di interesse da analizzare. (Ad esempio tessuto tumorale rispetto tessuto adiposo).
4. Identificare le cellule individuali basate su DAPI-macchia. Citoplasma sarà definito automaticamente in base alla forma del nucleo.
5. Scegli il fluorescente di intensità read-out di scelta per ciascun parametro fluorescente (ad esempio media, deviazione standard)
6. Batch il acquisito le immagini e lasciare che il processo software utilizzando l'algoritmo proposto.
7. Quando l'elaborazione delle immagini è terminata, unirei file dei risultati.
8. Aprire i risultati in Excel (o qualsiasi altro pacchetto software di analisi) e tracciare due intensità di fluorescenza contro l'altro sull'asse XY. Ogni intensità fluorescente è dato per cella. Le cellule doppio positive appariranno nel quadrante in alto a destra. L'utente deve definire le intensità di fluorescenza di base.

Results

Usando una tecnica di imaging multispettrale per analizzare i tumori innestati nel nostro modello di topo transgenico BMT, siamo in grado di discernere i componenti tumori stromali che sono di origine midollare. Il primo BMT è stata confermata tre settimane post-trapianto mediante citometria di flusso (Figura 1). Ortotopicamente iniettato tumori ovarici senza etichetta seguente BMT conferme attecchimento sono stati asportati e fissati in formalina 6 settimane dopo l'iniezione iniziale del tumore. Paraff...

Discussion

Qui si descrive l'applicazione dell'imaging multispettrale descriviamo come interrogazione MIMicc-multispettrale di composizioni cellulari multiplexati, per analizzare le componenti stromali del midollo osseo derivate del microambiente tumorale, tuttavia questa metodologia e concetto può essere applicato per decifrare altri elementi cellulari che compongono un complesso tessuti come quelli osservati durante le reazioni di cicatrizzazione o durante un tessuto rigenerativo. In questi esperimenti utilizziamo topi t...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
.2 μ m filtro	Fisher	09-740-35A
10 ml lure lock	BD	309604
ago da 25 G Filtro	Cardinal	BF305122
40nm	BD	352340
tubo conico da 50 ml	Fisher	1495949A
Alexafluor 488-ms1	invitrogen	A21121
Alexafluor 594-RB	invitrogen	A21207
Alexafluor 647-ch	Invitrogen	A21449
BSA	Sigma	A7906-500G
Vetrini coprioggetti	Corning	2940-243
CRI-Nuance	Calibro Life Sciences
Dapi	Invitrogen	D1306
DMEM	CellGro	10-017-CV
Etanolo	Dharmacon	4004-DV
FBS	invitrogen	16000-044
GFP-ms1	Abcam	ab38689
Ago per insulina	BD	329424
Acido maleico	Acros	100-16-7
Scatola della camera di umidità	Evergreen	240-9020-Z10
Mezzi di montaggio	dako	S3023
Indurente per unghie	Sally Hansen	2103
Pap pen	Abcam	Ab2601
Pen/Strep L Glut	invitrogen	10378016
Steril PBS	invitrogen	14040-182
Trypsin	invitrogen	252000-56
Blocking Buffer acido maleico 14.51 g NaCl 10.95 g NaOH pellet (a 7,5pH) 9+g Acqua distillata 250 ml *aggiungere lo 0,2% di Tween-20 a 1x soluzione per tampone bloccante con 2%BSA/2%FBS. Mescola e filtra. Tampone per il recupero dell'antigene: Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9,0) Tris Base 1,21 g EDTA 0,37 g Acqua distillata 1000 ml (100 ml per fare 10x, 50 ml per fare 20x) Tween 20 0,5 ml *Conservare presso RT per 3 mesi o a 4 gradi; C per più lungo Tampone Citrato di Sodio (10 mM Citrato di Sodio, 0.05% Tween 20, pH 6.0) Citrato trisodico (diidrato) 2.94 g Acqua distillata 1000 ml HCl (regolare il pH a 6,0) 1N Tween 20 0,5 ml