La proteina di legame al DNA dalle cellule affamate (DPS) gioca un ruolo cruciale nella lotta contro lo stress batterica. Questo articolo discute la purificazione E. coli PS e il protocollo per un In vitro Test dimostrando protezione Dps-mediata di DNA dalla degradazione dalle specie reattive dell'ossigeno.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo stress ossidativo è un sottoprodotto inevitabile della vita aerobica. L'ossigeno molecolare è essenziale per il metabolismo terrestre, ma partecipa anche a molte reazioni dannose all'interno di organismi viventi. La combinazione di metabolismo aerobico e di ferro, che è un altro composto essenziale per la vita, è sufficiente a produrre radicali attraverso la chimica di Fenton e degradare componenti cellulari. Degradazione del DNA è probabilmente il processo più dannosa che coinvolgono radicali intracellulari, come la riparazione del DNA è tutt'altro che banale. Il saggio presentato in questo articolo offre una tecnica quantitativa per misurare e visualizzare l'effetto delle molecole ed enzimi sui danni al DNA radicale-mediata.
Il saggio di protezione del DNA è un semplice, rapido, e robusto strumento per la caratterizzazione in vitro delle proprietà protettive delle proteine o prodotti chimici. Esso consiste nell'esporre DNA ad una reazione ossidativa dannosa e aggiungendo concentrazioni varianti del composto di interesse. La riduzione o l'aumento di danno al DNA in funzione della concentrazione del composto è quindi visualizzato mediante elettroforesi su gel. In questo articolo si dimostra la tecnica del saggio di protezione del DNA misurando le proprietà protettive della proteina legante il DNA dalle cellule affamate (DPS). DPS è un mini-ferritina che è utilizzato da più di 300 specie di batteri per combattere con forza di stress ambientale. Qui vi presentiamo il protocollo di purificazione Dps e le condizioni di analisi ottimizzate per valutare la protezione del DNA dal Dps.
Introduzione
Organismi aerobici devono lottare costantemente con le specie reattive dell'ossigeno che possono danneggiare il DNA e altre macromolecole biologiche cruciali. Uno strumento potente per contrastare gli effetti tossici del danno ossidativo è la proteina legante il DNA dalle cellule affamate (DPS). Fin dalla sua scoperta nel 1992 da fame E. coli cultura 1, Div. è stata identificata in più di 300 specie di batteri e archeobatteri 2. Upregulation massiccia di Dps durante la fase stazionaria lo rende il più altamente espresso proteina nucleoide-associato di E. coli in condizioni di fame 3, 4. Inoltre, Dps ha mostrato di preservare sia la vitalità batterica e l'integrità del DNA durante molte diverse sollecitazioni, tra cui la fame, ad alta concentrazione di ferro, l'esposizione alla luce UV, shock termico, e lo stress ossidativo 5, 6.
Strutturalmente, Dps auto-soci in un complesso stabile omo-oligomeri di 12 monomeri, which assemblare in un guscio vuoto sferico. Il ~ 4.5 nm-wide cavità interna è accessibile al solvente esterno attraverso pori che permettono il passaggio di piccole molecole 7, e può sequestrare metalli come ferro mineralizzati 8. L'effetto protettivo del Dps deriva dalle sue molteplici attività biochimiche, che comprendono non specifico DNA binding 1, l'attività ferrossidasica e deposito di ferro 8.
Studio dettagliato delle benefiche attività biochimiche del Dps richiede prima la sua purificazione. DPS purificazione è una procedura complessa, come PS devono essere separati non solo da altre proteine, ma anche da qualsiasi DNA legato 7. Nostro processo di purificazione ottimizzato utilizza molte tecniche comuni, costituito da due colonne di scambio ionico e di un passo precipitazione di solfato di ammonio. Sono necessari molti scambi di buffer, come Dps alta concentrazione possono precipitare dalla soluzione in condizioni di basso contenuto di sale. Una volta Dps proteina è stata purificata, Esso può essere applicato a saggi che misurano direttamente la sua attività ferrossidasica 8, stechiometria DNA-binding 9, e meccanismi di ferro vincolante 10. Dps purificate ha anche altre applicazioni potenziali. La struttura sferica cava stabile di DPS è stato utilizzato come impalcatura per la memorizzazione di particelle idrofobe all'interno della cavità proteina 11 e anche come camera di reazione per sintetizzare nuove nanoparticelle magnetiche 12.
La capacità protettiva del Dps di mediare i danni derivanti da specie reattive dell'ossigeno può essere chiaramente e direttamente dimostrato utilizzando il saggio di protezione del DNA 13, 14. In questa procedura in vitro, specie radicali sono prodotti quando ferro catalizza H 2 O 2 degradazione attraverso la chimica Fenton. Questi radicali danneggiare direttamente DNA presente nella reazione e possono degradare completamente a concentrazioni elevate. Due principali attività DPS può sia contrastare direttamente gli effetti di Fentproduzione di radicali on-mediata. Dps abbassa la concentrazione di ferro catalitico mediante mineralizzazione, consumando il perossido di idrogeno disponibile nel processo. Inoltre, Dps legame al DNA possono potenzialmente proteggerlo fisicamente dai danni dei radicali e lo condensa in un volume più piccolo con superficie meno reattivo. La combinazione di queste due proprietà rende il saggio di protezione DNA adatto per lo scopo di misurare l'attività protettiva Div..
Il saggio di protezione Il DNA è molto versatile e può essere utilizzato per una varietà di applicazioni oltre caratterizzazione Div.. I danni dei radicali è una comune forma di stress nelle cellule, e molte proteine e sostanze chimiche diverse sono utilizzati per contrastarla. Il principio generale del saggio, l'integrità del DNA utilizzando come marker per danni radicale, può essere utilizzato in combinazione con qualsiasi reazione producono radicali o un agente di contrasto. Tra gli altri, il saggio è stato usato con successo per determinare le proprietà anti-ossidantidi K. Estratto paniculata per l'industria alimentare 15, per caratterizzare gli effetti di acido urico a danno idrossile mediazione 16, e di acquisire nuove informazioni sulla funzione delle proteine Fur regolatore trascrizionale 17.
Nonostante i numerosi usi del saggio in articoli pubblicati, abbiamo scoperto che molti di ottimizzazione e risoluzione dei problemi sono stati richiesti, il che rende l'impostazione del test per la prima volta un processo inutilmente faticoso per molti ricercatori. Il protocollo che presentiamo in questo articolo si propone di rimuovere questa barriera per l'ingresso.
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Protocollo
1. Dps espressione e purificazione
Ottenimento di proteine di elevata purezza è un primo passo essenziale per il saggio di DNA-protezione. Purificazione di proteine Dps può essere eseguita in 4 o 5 giorni.
- Trasformare un ceppo proteasi carente di E. coli (come BL21 (DE3) pLysS) con un vettore pET (come pET17) in cui è stato clonato la sequenza codificante proteina-PS.
- Streak l'trasformato cellule affaccia Luria Broth (LB) piastre di agar contenenti antibiotici appropriati (come l'ampicillina e cloramfenicolo per gli esempi forniti in 1.1). Incubare le piastre notte a 37 ° C.
- Inoculare una singola colonia dalla piastra in 30 ml di terreno LB contenente antibiotici appropriati. Incubare per una notte a 37 ° C agitando a 200-250 rpm.
- Inoculare 2 x 1 L terreno LB contenente antibiotici appropriati con 10 ml ciascuna di coltura durante la notte. Crescere a 37 ° C, agitando, a OD 600 di circa 0,6. (Crescente celle a maggiori aumenti OD resa di proteine, senza compromettere sensibilmente la purezza del prodotto finale.) Indurre l'espressione di Dps aggiungendo IPTG ad una concentrazione di 0,3 mM, e incubare a 37 ° C per 3-4 ore agitando.
- Celle di raccolta per centrifugazione a 6000 xg per 15 min. Risospendere il pellet di cellule in 7,5 ml di DEAE tampone A (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA) per L di coltura cellulare indotta. Campioni possono essere congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C, se desiderato. La procedura può essere continuato dalle scongelamento dei campioni in un bagno di acqua a 4 ° C.
- Aggiungere una miscela di inibitori delle proteasi (come Calbiochem III set inibitori della proteasi, a 0,167 ml per ml di sospensione cellulare) alla sospensione cellulare impedire il degrado del Dps overexpressed.
- Preparare l'estratto privo di cellule utilizzando una stampa francese. Primo la stampa francese con 20 ml DEAE tampone A (se si utilizza un modello a flusso continuo), quindi alcuna interruzione,t il campione due volte a 20 kpsi. Centrifugare il lisato a 30.000 xg per 35 min a 4 ° C per chiarire particelle insolubili, e salvare il surnatante. Il supernatante può allora essere congelato con azoto liquido e conservato a -80 ° C, se desiderato.
- Equilibrare un ml DEAE Sepharose colonna 30 CL-6B con DEAE tampone A, utilizzando un FPLC. Esegui tampone attraverso la colonna a 1-2 ml / min con una pressione massima di 0,2 MPa su sfondo. Caricare l'estratto cellulare sulla colonna, e cominciare a raccogliere il flusso attraverso una volta che il segnale OD 280 comincia ad aumentare sopra del basale. Lavare la colonna con DEAE tampone A fino a quando il valore di OD 280 ritorna al basale, mentre continua la raccolta del flusso passante. Il passaggio di flusso dovrebbe contenere la maggior parte della proteina Dps, libera da DNA legato. Lavare la colonna con il 100% tampone B (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 1 M di NaCl, 0,1 mM EDTA). Questo eluato contiene complessi Dps-DNA così come altre proteine e può essere scartato.
- Rimuovere annunciozionale proteine contaminanti attraverso ammonio solfato di precipitazione. Determinare il volume del pool di flusso continuo. Lentamente (in un periodo di 10-20 min) aggiungere secco solfato di ammonio a paglia al 62% di saturazione (390 mg per ml di soluzione) a 4 ° C agitando bene. Lavorare l'impasto per un ulteriore 20-30 minuti dopo aver aggiunto l'ultima parte del solfato di ammonio per garantire la completa equilibrio. DPS rimarranno solubile, mentre le proteine contaminanti saranno precipitare dalla soluzione.
- Rimuovere proteine precipitate mediante centrifugazione a 20.000 xg per 30 min a 4 ° C e salvare il supernatante.
- Lentamente aggiungere un supplemento di 227 mg di solfato di ammonio per ml di surnatante di raggiungere il 94% di saturazione e mescolare per 20-30 minuti per garantire la completa equilibrio. DPS precipitati a questa concentrazione di sale e possono essere raccolti per centrifugazione a 20.000 xg per 30 min a 4 ° C. DPS saranno nel pellet, il supernatante può essere scartato. Il pellet può essere conservato a -80 ° C se desIred.
- Risospendere il Dps contenenti pellet in Resuspension Buffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Regolare il volume del campione di 2,5 ml.
- Scambio di tamponi per allontanare il solfato di ammonio, utilizzando una colonna di filtrazione PD-10 gel. Equilibrare il letto con gel 25 ml Resuspension Buffer. Applicare il ml 2,5 di Dps campione alla parte superiore della colonna PD-10 e lasciare in ammollo dentro Eliminare il flusso continuo. Raccogliere Dps eluendo con 3,5 ml Resuspension Buffer.
- Centrifugare il buffer a scambio campione a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C per rimuovere i componenti insolubili, e diluire con 6-10 ml di tampone di diluizione (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 0,1 mM EDTA) per garantire che la concentrazione di sale è abbastanza basso per il Dps di legare alla colonna SP Sepharose. Campioni particolarmente concentrate di DPS può diventare meno solubili su di diluizione in un tampone inferiore-sale, come evidenziato da nebulosità del liquido, ma possono essere completamente resolubilized con l'aggiunta di un piccolo Amount 5 M NaCl (un ulteriore 10-20 mm).
- Equilibrare un ml SP Sepharose colonna flusso veloce con 30 SP tampone A (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Esegui tampone attraverso la colonna a 1,5-2 ml / min, con un limite di pressione di 0,3 MPa su sfondo. Caricare il campione attraverso la colonna. Lavare con SP tampone A fino a quando le OD 280 traccia ritorna alla linea di base, e scartare il flow-through. Eseguire un gradiente lineare da 150 ml da 0 al 100% Tampone B, mentre la raccolta 2 frazioni ml. DPS eluiscano in un forte picco intorno al 50% B, sebbene variazione del 10% è possibile.
- Eseguire le frazioni di eluizione su un gel SDS-PAGE 15%, e verificare la presenza di contaminazione da DNA misurando il rapporto di 280 OD 260 / OD utilizzando uno spettrofotometro. Il gel deve mostrare solo una banda di circa 19 kDa, e la OD 260 / OD 280 è in genere intorno a 0.7. La piscina per i più puri Dps frazioni. Utilizzare un gruppo filtro centrifugo (come il Amicon Ultra Filtration Unit) con un10K peso molecolare di cut-off per concentrare il DPS e scambiarli in un buffer di memoria (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 50 mM di NaCl). Aliquota della Dps purificati, e congelare in azoto liquido per la conservazione a -80 ° C.
2. Protezione DNA Assay
Il saggio coinvolge più passaggi sensibili al tempo e dovrebbe essere cronometrato al secondo per ottenere risultati riproducibili. Molti ingredienti e le fasi di pipettaggio sono coinvolti, in modo da un tavolo di pipettaggio (vedi tabella 1) Si consiglia di tenere traccia dei passaggi e dei volumi. Il tempo totale richiesto per il dosaggio è non più di 3 ore.
- Misurare 30 ml di acqua in un flacone ermetico; lavare l'acqua con N 2 per 10 min (usando due aghi siringa, una nel fluido, uno sopra di esso) per rimuovere l'ossigeno dalla soluzione. Aggiungi 0,0168 g FeSO4 • 7H 2 O per l'acqua per ottenere una soluzione madre di 2 mm. Si chiude la fiala e lavare con azoto per 5 minuti di più, poi mescolare. La soluzione deve esserechiaro, se ogni accenno di giallo è rilevabile, preparare una nuova soluzione di ferro.
- Fare un 100 mm H 2 O la soluzione 2 (10,87 ml di 9.2MH 2 O 2 in 1 ml di acqua); tenere in ghiaccio e al riparo dalla luce avvolgendolo in un foglio di alluminio. Utilizzare solo per circa 1-2 ore dopo la preparazione a causa di decadimento spontaneo. Il perossido di idrogeno è disponibile similmente soggetta a guasti, che possono essere parzialmente alleviate corretta conservazione (al buio a 4 ° C). Sono consigliati controlli regolari della concentrazione stock di misurare i 240 OD.
- Scongelare una aliquota di purificata Dps rapidamente in un bagno d'acqua a temperatura ambiente, e tenere in ghiaccio. Centrifugare per 10 secondi a 4000 xg in un tavolo picocentrifuge ad aggregati precipitato. Misurare la concentrazione dopo centrifugazione utilizzando uno spettrofotometro (OD 280 = 1,547 indica una concentrazione di 100 mM Div. monomero).
- Diluire il DNA lineare da alta concentrazione di magazzino utilizzando 12x tampone di reazione (1M MOPS-KOH pH 7,0, NaCl 1 M) ad una concentrazione di 100 ng / mL. DNA lineare è usata per rendere più facile quantificazione, ma il DNA plasmidico può essere utilizzato come bene.
- Pipettare 1 ml di miscela di DNA-buffer in un tubo di PCR. Aggiungere abbastanza acqua nella reazione in modo che il volume di reazione finale (meno SDS) sarà di 12 microlitri. Tale importo deve essere calcolato in anticipo utilizzando la tabella di pipettaggio. Aggiungi Dps ad una concentrazione finale dodecamero di 3 micron. Incubare per 15 min a temperatura ambiente per permettere Div. di legarsi al DNA.
- Aggiungere abbastanza 2 mM soluzione FeSO 4 per raggiungere la concentrazione desiderata. Un tipico esperimento utilizza un intervallo di concentrazioni da 0 a 1 mM FeSO4. Concentrazioni maggiori causerà più ampio degradazione del DNA, ma può anche portare alla formazione di precipitati ferrico nella miscela di reazione. Aggiungere rapidamente 1 mM microlitri della soluzione di H 2 O 2 100 (a concentrazione finale 10 mM), e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti per consentire la FentonMediata reazione di degradazione di prendere posto.
- Aggiungere 0,8 ml di 20% SDS (sodio dodecil solfato). Mescolare ed incubare a 85 ° C per 5 minuti per distruggere i complessi Dps-DNA. La SDS destabilizza il complesso Dps-DNA e impedisce spostamenti indesiderati gel per il DNA, che migliora la facilità di quantificazione. Un passo opzionale è fermare la reazione catalitica degradando il perossido di idrogeno in prodotti non tossici. Per le condizioni descritte in questo protocollo, questa fase non è necessaria per ottenere una vasta gamma di degradazione del DNA.
- Incubare in ghiaccio per 1 min, aggiungere colorante di caricamento, e caricare su un gel di agarosio. Esegui il gel, e colorare per DNA usando bromuro di etidio. Il gel deve essere colorato post-elettroforesi anziché prima dell'elettroforesi, per evitare che la SDS di interferire con la distribuzione bromuro di etidio nel gel.
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Risultati
Il processo di purificazione per il Dps qui descritto è molto riproducibile. Dps purificazione secondo il protocollo descritto, utilizzando 2 L di E. cultura coli come punto di partenza, sarà tipicamente resa 2,5 ml di proteina contenente Div. 12 a concentrazioni comprese tra 5 e 12 mM. Tempi di induzione più lunghi (4 ore) sembrano ridurre questa variabilità. Purezza proteina è costantemente al di sopra del 99%, come evidenziato da SDS-PAGE gel (Figura 1). Il livello di con...
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Discussione
Il processo di purificazione Div. come descritto in questo articolo è molto robusto. La purezza è stata assai alta (> 99%); altre proteine appaiono su SDS-PAGE gel come bande visibili. Nonostante questo, alcuni lotti di Dps purificati sembrano avere attività nucleasi, come dimostra la degradazione del DNA parziale quando incubate con concentrazioni molto elevate di Dps. Ciò potrebbe indicare la presenza di DNasi altamente attivi a bassa concentrazione che non siamo riusciti a rimuovere attraverso la purificazione. ...
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Siamo grati a Michela de Martino, Wilfred R. Hagen, e Kourosh Honarmand Ebrahimi per utili discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti di avviamento dalla Delft University of Technology.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BL21(DE3)pLysS cellule competenti | Promega | L1195 | |
| pET-17b DNA | EMD-Millipore | 69663-3 | |
| LB brodo in polvere | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Ampicillina sale sodico | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| Cloramfenicolo | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| HEPES | BDH | 441476L | |
| Idrossido di potassio | Merck | 105033 | |
| Cloruro di sodio | VWR | 443824T | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Iniettore della proteasi Cocktail Set III | EMD-Millipore | 539134 | |
| DEAE-Sepharose | Sigma-Aldrich | DFF100 | |
| Solfato di ammonio | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| PD-10 Colonne di desalinizzazione | GE Healthcare LS | 17-0851-01 | |
| SP-Sepharose | Sigma-Aldrich | S1799 | |
| Amicon Ultra Centr. Filtro (10K MWCO) | Millipore | UFC901024 | |
| Solfato ferroso eptaidrato | Sigma-Aldrich | F8048 | |
| Soluzione di perossido di idrogeno | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| MOPS | Calbiochem | 475898 | |
| Soluzione SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Bromuro di etidio | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Incubatrice statica | Hettich | INE500 | |
| Incubatrice ad agitazione | New Brunswick Sc. | Inova 44 | |
| Centrifuga raffreddata | Beckman Coulter | Avanti J-E | |
| Centrifuga da tavolo | Eppendorf | 5424 | |
| Disgregatore di celle | Constant Systems Ltd. | TS2/40/AA/AA | |
| FPLC Purificatore | General Electric | AKTA | |
| Fiale ermetiche | Cole-Parmer | EW-08918-85 | |
| Aghi per siringa | BD | 305128 | |
| Pipette | Eppendorf | Z683779-1EA, Z683795-1EA |
Riferimenti
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