La proteina di legame al DNA dalle cellule affamate (DPS) gioca un ruolo cruciale nella lotta contro lo stress batterica. Questo articolo discute la purificazione E. coli PS e il protocollo per un In vitro Test dimostrando protezione Dps-mediata di DNA dalla degradazione dalle specie reattive dell'ossigeno.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo stress ossidativo è un sottoprodotto inevitabile della vita aerobica. L'ossigeno molecolare è essenziale per il metabolismo terrestre, ma partecipa anche a molte reazioni dannose all'interno di organismi viventi. La combinazione di metabolismo aerobico e di ferro, che è un altro composto essenziale per la vita, è sufficiente a produrre radicali attraverso la chimica di Fenton e degradare componenti cellulari. Degradazione del DNA è probabilmente il processo più dannosa che coinvolgono radicali intracellulari, come la riparazione del DNA è tutt'altro che banale. Il saggio presentato in questo articolo offre una tecnica quantitativa per misurare e visualizzare l'effetto delle molecole ed enzimi sui danni al DNA radicale-mediata.
Il saggio di protezione del DNA è un semplice, rapido, e robusto strumento per la caratterizzazione in vitro delle proprietà protettive delle proteine o prodotti chimici. Esso consiste nell'esporre DNA ad una reazione ossidativa dannosa e aggiungendo concentrazioni varianti del composto di interesse. La riduzione o l'aumento di danno al DNA in funzione della concentrazione del composto è quindi visualizzato mediante elettroforesi su gel. In questo articolo si dimostra la tecnica del saggio di protezione del DNA misurando le proprietà protettive della proteina legante il DNA dalle cellule affamate (DPS). DPS è un mini-ferritina che è utilizzato da più di 300 specie di batteri per combattere con forza di stress ambientale. Qui vi presentiamo il protocollo di purificazione Dps e le condizioni di analisi ottimizzate per valutare la protezione del DNA dal Dps.
Introduzione
Organismi aerobici devono lottare costantemente con le specie reattive dell'ossigeno che possono danneggiare il DNA e altre macromolecole biologiche cruciali. Uno strumento potente per contrastare gli effetti tossici del danno ossidativo è la proteina legante il DNA dalle cellule affamate (DPS). Fin dalla sua scoperta nel 1992 da fame E. coli cultura 1, Div. è stata identificata in più di 300 specie di batteri e archeobatteri 2. Upregulation massiccia di Dps durante la fase stazionaria lo rende il più altamente espresso proteina nucleoide-associato di E. coli in condizioni di fame 3, 4. Inoltre, Dps ha mostrato d....
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Protocollo
1. Dps espressione e purificazione
Ottenimento di proteine di elevata purezza è un primo passo essenziale per il saggio di DNA-protezione. Purificazione di proteine Dps può essere eseguita in 4 o 5 giorni.
- Trasformare un ceppo proteasi carente di E. coli (come BL21 (DE3) pLysS) con un vettore pET (come pET17) in cui è stato clonato la sequenza codificante proteina-PS.
- Streak l'trasformato cellule affaccia Luria Broth (LB) piastre di agar contenenti antibiotici appropriati (come l'ampicillina e cloramfenicolo per gli esempi forniti in 1.1). Incubare le piastre notte a 37 ° C.
- Inoculare un....
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Risultati
Il processo di purificazione per il Dps qui descritto è molto riproducibile. Dps purificazione secondo il protocollo descritto, utilizzando 2 L di E. cultura coli come punto di partenza, sarà tipicamente resa 2,5 ml di proteina contenente Div. 12 a concentrazioni comprese tra 5 e 12 mM. Tempi di induzione più lunghi (4 ore) sembrano ridurre questa variabilità. Purezza proteina è costantemente al di sopra del 99%, come evidenziato da SDS-PAGE gel (Figura 1). Il livello di con.......
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Discussione
Il processo di purificazione Div. come descritto in questo articolo è molto robusto. La purezza è stata assai alta (> 99%); altre proteine appaiono su SDS-PAGE gel come bande visibili. Nonostante questo, alcuni lotti di Dps purificati sembrano avere attività nucleasi, come dimostra la degradazione del DNA parziale quando incubate con concentrazioni molto elevate di Dps. Ciò potrebbe indicare la presenza di DNasi altamente attivi a bassa concentrazione che non siamo riusciti a rimuovere attraverso la purificazione. .......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Siamo grati a Michela de Martino, Wilfred R. Hagen, e Kourosh Honarmand Ebrahimi per utili discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti di avviamento dalla Delft University of Technology.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BL21(DE3)pLysS cellule competenti | Promega | L1195 | |
| pET-17b DNA | EMD-Millipore | 69663-3 | |
| LB brodo in polvere | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Ampicillina sale sodico | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| Cloramfenicolo | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| HEPES | BDH | 441476L | |
| Idrossido di potassio | Merck | 105033 | |
| Cloruro di sodio | VWR | 443824T | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Iniettore della proteasi Cocktail Set III | EMD-Millipore | 539134 | |
| DEAE-Sepharose | Sigma-Aldrich | DFF100 | |
| Solfato di ammonio | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| PD-10 Colonne di desalinizzazione | GE Healthcare LS | 17-0851-01 | |
| SP-Sepharose | Sigma-Aldrich | S1799 | |
| Amicon Ultra Centr. Filtro (10K MWCO) | Millipore | UFC901024 | |
| Solfato ferroso eptaidrato | Sigma-Aldrich | F8048 | |
| Soluzione di perossido di idrogeno | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| MOPS | Calbiochem | 475898 | |
| Soluzione SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Bromuro di etidio | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Incubatrice statica | Hettich | INE500 | |
| Incubatrice ad agitazione | New Brunswick Sc. | Inova 44 | |
| Centrifuga raffreddata | Beckman Coulter | Avanti J-E | |
| Centrifuga da tavolo | Eppendorf | 5424 | |
| Disgregatore di celle | Constant Systems Ltd. | TS2/40/AA/AA | |
| FPLC Purificatore | General Electric | AKTA | |
| Fiale ermetiche | Cole-Parmer | EW-08918-85 | |
| Aghi per siringa | BD | 305128 | |
| Pipette | Eppendorf | Z683779-1EA, Z683795-1EA |
Riferimenti
- Almiron, M., Link, A. J., Furlong, D., Kolter, R. A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli. Genes Dev. 6, 2646-2654 (1992).
- Chiancone, E., Ceci, P.
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Ristampe e permessi
