Descriviamo un metodo riproducibile di preparazione del mouse pancreatiche cellule acinose da un mouse con lo scopo di esaminare i segnali di calcio delle cellule acinose e lesioni cellulari con stimoli fisiologicamente e patologicamente rilevanti. Viene inoltre fornito un metodo per l'infezione adenovirale di queste cellule.
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Articolo metodologico
Preparazione delle cellule acinose pancreatiche per lo Scopo di Imaging di calcio, cellulari lesioni Misure e Infezione Adenoviral
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'cellule acinose pancreatiche è il principale parenchima cellulare del pancreas esocrino e svolge un ruolo primario nella secrezione di enzimi pancreatici nel dotto pancreatico. E 'anche il sito per l'avvio di pancreatite. Qui si descrive come le cellule acinose sono isolati da tutto il tessuto del pancreas e dei segnali intracellulari di calcio sono misurati. Inoltre, si descrivono le tecniche di trasfezione queste cellule con costrutti adenovirali, e successivamente misurando la fuoriuscita di lattato deidrogenasi, un marker di danno cellulare, in condizioni che inducono lesioni cellule acinose in vitro. Queste tecniche forniscono un potente strumento per la caratterizzazione delle cellule acinose fisiologia e patologia.
Introduzione
Cambiamenti dinamici nel calcio citosolico sono necessari per gli eventi delle cellule acinose sia fisiologiche che patologiche. Questi effetti divergenti di calcio sono pensati per derivare da diversi modelli spaziali e temporali di calcio di segnalazione 1. Per esempio, enzimi e la secrezione fluido dalla cellule acinose sono legate a picchi di calcio da una regione ristretta del polo apicale in cui la secrezione avviene 2. Al contrario, un'onda calcio globale seguito da intensi segnali di calcio non-oscillatorie è associato ad eventi patologici precoci che portano alla pancreatite acuta 3,4. Questi includono attivazione intra-a....
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Protocollo
1. Preparazione acinose pancreatiche Cellule per Imaging di calcio
- Preparare HEPES tampone di incubazione contenente HEPES 20 mM, 95 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM MgCl2, 1.3 mM CaCl 2, 10 mM di glucosio, 2 mM glutammina, e 1 × medie aminoacidi non essenziali del minimo Aquila. Regolare la soluzione finale a pH 7.4 con NaOH.
- Preparare un tampone di incubazione aggiungendo BSA BSA (1% w / v finale) a 25 ml di tampone di incubazione HEPES (descritta sopra).
- Preparare un tampone di digestione collagenasi aggiungendo 1,1 mg / ml (200 Unità / ml) di tipo-4 collagenasi e 1 mg / ml di inibitore della tripsina di soia per 6 m....
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Risultati
Un esempio di misurazioni calcio delle cellule acinose in risposta a stimoli fisiologici è fornita in figura 3. Cellule acinose state caricate con il colorante calcio Fluo-4 e perfusi con l'acetilcolina analogico carbachol (CCH, 1 mM)) 8. Cellule risposto nella forma di un'onda di calcio che avvia nella regione apicale e propaga alla regione basolaterale 3,9. Tracciati Rappresentante mostrato in Figura 3B dimostrano il tipico modello di punta plateau comune.......
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Discussione
Il metodo di isolamento delle cellule e saggi successivi raffigurati qui rappresentano potenti strumenti con cui studiare le caratteristiche fisiologiche e fisiopatologiche del pancreas esocrino. Il metodo per isolare le cellule acinose pancreatiche dispersi è stato descritto da Amsterdam e Jamieson nel 1972 11. I metodi qui presentati sono stati adattati da più recenti metodi di isolamento descritte da Van Acker e colleghi 12. Sebbene queste tecniche sono altamente riproducibili e facilmente appre.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da un National Institutes of Health di Grant DK083327 e DK093491 (a CSPS).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Topi | NCI N/A | Maschio 20-30 grammi; praticamente qualsiasi ceppo dovrebbe produrre risultati comparabili. | |
| HEPES | American Bioanalytical | AB00892 | |
| Cloruro di sodio | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Cloruro di potassio | J.T. Baker | 3040-01 | |
| Cloruro di magnesio | Sigma | M-8266 | |
| Cloruro di calcio | Fischer | C79 | |
| Destrosio | J.T. Baker | 1916-01 | |
| L-Glutammina | Sigma | G-8540 | |
| 1X minimo Miscela di aminoacidi non essenziali media di Eagle's | Gibco | 11140-050 | |
| Idrossido di sodio | EM | SX0593 | |
| Albumina sierica bovina | Sigma | A7906 | |
| Collagenasi | Worthington | 4188 | |
| Inibitore della tripsina di soia | Sigma | T-9003 | |
| Anidride carbonica | Matheson Gas | 124-38-9 | |
| 125 ml Pallone di plastica Erlenmeyer | Crystalgen | 26-0005 | |
| Kit di dissezione | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| 70% Etanolo | LabChem | LC222102 | |
| P1000, P100, P10 pipette | Gilson | FA10005P | |
| Barca di pesata | Heathrow Scientific | HS1420A | |
| Pipette di trasferimento in plastica | USA Scientific | 1020-2500 | |
| Provette coniche da 15 ml | BD Falcon | 352095 | |
| Provette coniche da 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| Provetta per microcentrifuga da 1,5 ml | Fisher | 05-408-129 | |
| Provetta per microcentrifuga da 0,65 ml | VWR | 20170-293 | |
| Vetrini coprioggetti 22 x 22 mm | Fisher | 032811-9 | |
| Acido nitrico | Fischer | A483-212 | |
| Acido cloridrico | Fischer | A142-212 | |
| Acqua deionizzata | N/A | N/A Vetrini coprioggetti | |
| 18 x 18 mm | Fischer | 021510-9 | |
| Pellicola da laboratorio | Parafilm | PM-996 | |
| Fluo-4AM | Invitrogen | F14201 | |
| Dimetilsolfossido | Sigma | D2650 | |
| Luer lock | Becton Dickinson | 932777 | |
| Siringa da 60 ml | BD Bioscience | DG567805 | |
| 23 ¾ ago di calibro | BD Bioscience | 9328270 | |
| Tubo PE50 | Clay Adam | PE50-427411 | |
| Cacciavite a testa piatta | N/A | N/A | |
| DMEM F-12, no Fenolo Rosso | Gibco | 21041-025 | |
| Ago calibro 30,5 | BD Bioscience | 305106 | |
| Siringa da 5 CC | BD Bioscience | 309603 | |
| Pallone Erlenmeyer da 25 ml | Fischer | FB50025 | |
| Filtro a rete in nylon | Nitex | 03-150/38 | 150 um dimensione dei pori 48 |
| pozzetti piastra per coltura tissutale | Costar | 3548 | |
| piastra per coltura tissutale a 96 pozzetti | Costar | 3795 | |
| piastra per coltura tissutale a 6 pozzetti | Costar | 3506 | |
| Azoto liquido | Matheson Gas | 7727-37-9 | |
| Kit per test di citotossicità | Promega | G1782 | |
| Adeno-GFP | N/A | N/A | Regalo da J. Williams |
| Equipment | |||
| Ring stand with clamps | United Scientific | SET462 | |
| Camera per perifusione | N/A | N/A | Progettato da S.Z.H e colleghi dell'Università di Yale |
| Linea del vuoto | Manostat | 72-100-000 | |
| Bagno d'acqua con agitatore | Microscopio | 51220076 | |
| Zeiss | LSM 710 | ||
| BioTek Synergy H1 lettore di piastre | BioTek | 11-120-534 | |
| Cappa per coltura tissutale | Nuaire | NU-425-600 | |
| Incubatore per coltura tissutale | Thermo | 3110 |
Riferimenti
- Toescu, E. C., Lawrie, A. M., Petersen, O. H., Gallacher, D. V. Spatial and temporal distribution of agonist-evoked cytoplasmic Ca2+ signals in exocrine acinar cells analysed by digital image microscopy. Embo J. 11, 1623-1629 (1992).
- Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H.
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Ristampe e permessi
