Questo articolo si concentra sulla identificazione di alta fiducioso set di dati di interazione tra ospite e patogeno proteine usando una combinazione dei due metodi ortogonali: lievito di doppio ibrido seguita da un saggio di interazione high-throughput in cellule di mammifero chiamato HT-GPCA.
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Articolo metodologico
Un approccio comparato alla caratterizzano il paesaggio di ospite-patogeno interazioni proteina-proteina
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Notevoli sforzi sono stati raccolti per produrre proteina-proteina mappe di rete di interazione su larga scala globale. Questo è fondamentale per comprendere le relazioni patogeno-ospite ed è stata eseguita essenzialmente da screening genetico nei lieviti sistemi a due ibridi. Il recente miglioramento della rilevazione interazione proteina-proteina da una luciferasi-based test di complementazione frammento Gaussia offre ora l'opportunità di sviluppare approcci comparativi interactomic integrativi necessari per confrontare rigorosamente profili di interazione di proteine provenienti da diverse varianti di ceppo patogeno nei confronti di un insieme comune di fattori cellulari.
Questo documento si concentra in particolare sulla utilità di combinare due metodi ortogonali per generare proteina-proteina set di dati di interazione: lievito di due ibridi (Y2H) e un nuovo saggio, high-throughput Gaussia princeps saggio di complementazione proteica (HT-GPCA) eseguita in cellule di mammifero. nt "> A identificazione su larga scala di partner cellulari di una proteina patogeno viene eseguita con l'accoppiamento a base di lievito proiezioni doppio ibrido di librerie di cDNA utilizzando molteplici varianti ceppo patogeno. Un sottoinsieme di partner interagenti selezionati su un punteggio alto confidenza statistica è ulteriormente convalidato in cellule di mammifero per le interazioni pair-wise con l'intero insieme di proteine varianti patogeni utilizzano HT-GPCA. Questa combinazione di due metodi complementari migliora la robustezza del set di dati di interazione, e consente l'esecuzione di una rigorosa analisi di interazione comparativa. Tali intergenomica comparativi costituire una strategia affidabile e potente per decifrare eventuali interazioni patogeno-ospite.
Introduzione
La crescente quantità di dati raccolti per generare mappe di interazione proteina-proteina apre prospettive per comprendere ulteriormente infezioni da patogeni. Poiché la comprensione globale di infezioni patogeno comincia ad emergere, fornisce accesso alla gamma delle perturbazioni indotte dalle proteine patogeni quando si collega il proteoma umano 1. E 'in tal modo offre un modo per capire come gli agenti patogeni manipolano il macchinario della cellula ospite. In particolare, la mappatura delle diverse reti di interazione virus-ospite ha rivelato che le proteine virali preferenzialmente proteine bersaglio host che sono fortemente connessi alla....
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Protocollo
1. Lievito Screenings doppio ibrido
- Effettuare le seguenti soluzioni richieste:
- Completa Out Goccia sintetico (SD): sciogliere 26,7 g di minima base di deviazione standard con il glucosio in 1 L di acqua. Aggiungere 2 g di miscela di aminoacidi preparato come segue: 2 g hemisulfate adenina, 2 g Arginina HCl, 2 g di HCl Istidina, Isoleucina 2 g, 4 g Leucina, Lisina HCl 2 g, 2 g Metionina, Fenilalanina 3 g, 2 g L -Serina, 2 g L-treonina, 3 g Triptofano, Tirosina 2 g, 1.2 g Uracile, 9 g Valina.
- Selective Cada Fuori SD-L/-W/-H: SD contenente ogni aminoacidi essenziali ad eccezione di quelli ....
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Risultati
Un punto di forza di HT-GPCA risiede nella sua elevata sensibilità, come illustrato dalla valutazione di tassi positivi e falsi negativi falsi per la proteina E2 di HPV nella Figura 2 (adattato dal riferimento 13). Per determinare il tasso di falsi negativi, note interazioni di E2 da HPV16 sono state valutate da HT-GPCA (Figura 2A). Quattro su 18 interazioni non sono stati recuperati (corrispondente ad un tasso di falso negativo 22%). Le interazioni falsi positivi sono stati misurati al.......
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Discussione
Indipendentemente, lievito-due saggi di interazione ibridi e mammiferi, come il GST pull-down, LUMIER o MAPPIT, hanno dimostrato di essere strumenti efficaci per individuare le interazioni proteina-proteina, ma sono limitati dal tasso elevato di falsi positivi e falsi negativi interazioni associate con queste tecniche 15. Inoltre, vi è sempre maggiore che combinando metodi ortogonali aumenta l'affidabilità dell'interazione dataset ottenuto 7. Il recente sviluppo della tecnica HT-GPCA descri.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un finanziamento della Institut Pasteur e da finanziamenti della Ligue nationale contre le Cancer (sovvenzioni R05/75-129 e RS07/75-75), l'Associazione pour la Recherche sur le Cancer (borse di ARC A09 / 1/5031 e il 4867), e l'Agence Nationale de la Recherche (ANR07 MIME 009 02 e ANR09 MIEN 026 01). MM è stato un destinatario di una borsa di studio MENRT.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ceppi di lievito | Clontech | ||
| Base SD minima Biologico | degli Stati Uniti | D9500 | |
| Aminoacidi | Sigma | ||
| 3-ammino-1,2,4-Triazolo (3-AT) | Acros organics | 264571000 | |
| Zymolase | Seikagaku | 120491 | |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 31966 | |
| Siero fetale bovino | BioWest | S1810 | |
| tampone fosfato, soluzione salina (PBS) | Gibco-Life Technologies | 14190 | |
| Penicillina-Streptomicina, | Gibco-Life Technologies | 15140 | |
| Tripsina-EDTA, | Gibco-Life Technologies | 25300 | |
| Renilla luciferasi, test | Promega | E2820 | |
| Bianco piastra per coltura | Greiner Bio-One | 655083 | |
| 96 pozzettiPiastre per PCR | 4titude | 4t-i0730/C | |
| Incubatore (30 ° C) | Incubatrice Memmert | ||
| (37 ° C) | Heraeus | ||
| Luminometro | Berthold | Centro XS-LB 960 |
Riferimenti
- Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. How viruses hijack cell regulation. Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).
- Calderwood, M. A. Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).
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Ristampe e permessi
