Citomegalovirus (HCMV), l'infezione umana di neonati rappresenta una importante causa di ritardo mentale, ma gli eventi molecolari che portano alla indotta da virus patogenesi sono ancora poco conosciuti. Per indagare le dinamiche di infezione del cervello, abbiamo adattato tutta-animale In vivo Di imaging per eseguire analisi in tempo-corso di neonati infettati con un virus luciferasi-ricombinante.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Citomegalovirus umano (HCMV o HHV-5) è un agente patogeno mortale in individui immunocompromessi. Su infezione congenita o neonatale, il virus può infettare e replicarsi nel cervello in via di sviluppo, che può indurre gravi danni neurologici, tra cui sordità e ritardo mentale. Nonostante il potenziale gravità dei sintomi, le opzioni terapeutiche sono limitate dalla mancanza di un vaccino e l'assenza di una specifica terapia antivirale. Inoltre, una descrizione precisa degli eventi molecolari che si verificano durante l'infezione del sistema nervoso centrale (SNC) è ancora carente dal osservazioni principalmente derivano dalla autopsia dei bambini infetti. Diversi modelli animali, come macaco rhesus CMV, sono stati sviluppati e importanti conoscenze CMV patogenesi nel SNC. Tuttavia, nonostante la vicinanza evolutiva con gli esseri umani, questo modello è stata limitata dalla procedura di inoculazione intracranica usato per infettare gli animali e controistently indurre infezione del SNC. Inoltre, considerazioni etiche hanno promosso lo sviluppo di modelli alternativi, tra i quali l'infezione neonatale di topi appena nati con citomegalovirus topo (MCMV) ha recentemente portato a significativi progressi. Ad esempio, è stato segnalato che l'iniezione intraperitoneale di MCMV a Balb / c neonati porta all'infezione di neuroni e cellule gliali in aree specifiche del cervello. Questi risultati suggeriscono che l'inoculazione sperimentale di topi potrebbe ricapitolare i deficit indotti da HCMV nei bambini. Tuttavia, un'analisi dinamica di MCMV infezione di neonati è di difficile esecuzione a causa classica metodologia richiede il sacrificio di un numero significativo di animali a differenti tempi di analizzare il carico virale e / o parametri immuno-correlati. Per aggirare questo ostacolo e permettere future indagini di animali mutanti rari, abbiamo applicato nella tecnologia di imaging in vivo per eseguire analisi in tempo-corso della viral disseminazione nel cervello a seguito di iniezione periferica di un MCMV ricombinante esprimente luciferasi di C57BL / 6 neonati.
Introduzione
Citomegalovirus umano (HCMV/HHV-5) è un membro della famiglia di β-herpesvirus. HCMV è altamente prevalente, patogeno opportunista che di solito è acquisito durante primi anni di vita come un'infezione asintomatica 1. Come tutti i virus erpetici, HCMV persiste per tutta la vita dell'ospite cui sistema immunitario strettamente controlla la replicazione virale. Gli episodi di riattivazione virale per lo più si verificano in individui immunocompromessi, come i pazienti di trapianto che assumono farmaci per prevenire il rigetto del trapianto 2. Negli adulti, HCMV è anche stato collegato a glioblastomi 3. Inoltre, HCMV è un patogen....
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Protocollo
1. Preparazione della sospensione virale
- Ottenere il ceppo Smith di MCMV esprimere luciferasi (MCMV-Luc 15) dal laboratorio di Ulrich Koszninowski. In questo ricombinante, il gene della luciferasi è inserito nel locus IE2 del genoma MCMV.
- Per amplificare MCMV-Luc, infettare un midollo linea di cellule stromali osseo murino (M2-10B4, ATCC # CRL-1972) con MCMV a diversa molteplicità di infezione (MOI, 0,001-1) 16. Per questo, aggiungere virus di cellule coltivate in mezzo privo di siero a 37 ° C. Dopo un'ora, rimuovere il supernatante e sostituirlo con DMEM supplementato con 10% siero fetale di vitello (FCS). Cinq....
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Risultati
Un esperimento rappresentativo è illustrato in Figura 1. A seguito di iniezione intraperitoneale di 50 PFUs di MCMV-Luc (Pannello A mostra una iniezione simile esercitata con blu di metilene di visualizzare via sottocutanea dell'ago), neonati sono stati anestetizzati e ricevuti simultaneamente 0,3 mg del substrato di luciferasi (Luciferin, compasso). Quindici minuti dopo, gli animali sono stati posti lato ventrale nella camera di acquisizione del IVIS 50 (In Vivo Imaging System, calibro) e la luce e.......
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Discussione
Utilizzando la tecnologia di imaging in vivo per monitorare MCMV-Luc diffusione in topi neonati, siamo stati in grado di osservare la diffusione virale nel cervello di animali mutanti, al contrario di wild-type. Ulteriore dissezione dell'animale e di imaging ex vivo del cervello ha confermato la presenza del virus luminescente nel sistema nervoso centrale. Inoltre, abbiamo anche effettuato immunoistochimica (non mostrato) su sezioni sottili cerebrali con un anticorpo specifico per la prote.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano assenza di competizione interesse finanziario.
Dichiarazione etica
Gli animali sono stati mantenuti in condizioni esenti da organismi patogeni nella funzione di cura degli animali della Institut d'Immunologie et d'Hématologie. Manipolazione dei topi e delle procedure sperimentali sono state condotte in conformità con la legge francese per la protezione di animali da laboratorio. La procedura è stata approvata dal servizio veterinario della Prefettura du Bas-Rhin (Francia) con il numero di autorizzazione A-67-345.
Ringraziamenti
Ringraziamo Lee Tuddenham (IBMC, Strasburgo) per amplificare e titolazione MCMV-Luc e Thomas Baumert (INSERM U748, Strasburgo) per il permesso di utilizzare la struttura animale dell'Istituto di Virologia. Il sostegno finanziario da INSERM, Université de Strasbourg e Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-MIEN-005-01) è riconosciuto. La partecipazione iniziale di Sonia Beroud e Laetitia Lelieur durante la loro progetto Master è inoltre riconosciuto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagent/Material | |||
| DMEM | Fisher Scientific | W3523A | |
| Blu di metilene | Sigma Aldrich | 319112 | |
| Aghi per insulina | VWR | 613-4897 | |
| Ketamina | CentraVet | Ket 201 | |
| Xilazina/Vetranal | Sigma Aldrich | 46995 | |
| DPBS | DUTSCHER | P0436500 | |
| Luciferin Caliper | 760504 | ||
| gentamicina | Sigma Aldrich | G1272 | |
| penicillina/streptomicina | Gibco | 15070 | |
| carbossimetilcellulosa | Sigma | Aldrich C4888 | |
| formaldeide | Sigma Aldrich | F8775 | |
| cristallo viola | Sigma Aldrich | C3886 | |
| Equipment | |||
| IVIS 50 | Caliper/Perkin Elmer |
Riferimenti
- Loewendorf, A., Benedict, C. A. Modulation of host innate and adaptive immune defenses by cytomegalovirus: timing is everything. J. Intern. Med. 267, 483-501 (2010).
- Lischka, P., Zimmermann, H. Antiviral strategies to combat cy....
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Ristampe e permessi
