Citomegalovirus (HCMV), l'infezione umana di neonati rappresenta una importante causa di ritardo mentale, ma gli eventi molecolari che portano alla indotta da virus patogenesi sono ancora poco conosciuti. Per indagare le dinamiche di infezione del cervello, abbiamo adattato tutta-animale In vivo Di imaging per eseguire analisi in tempo-corso di neonati infettati con un virus luciferasi-ricombinante.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Citomegalovirus umano (HCMV o HHV-5) è un agente patogeno mortale in individui immunocompromessi. Su infezione congenita o neonatale, il virus può infettare e replicarsi nel cervello in via di sviluppo, che può indurre gravi danni neurologici, tra cui sordità e ritardo mentale. Nonostante il potenziale gravità dei sintomi, le opzioni terapeutiche sono limitate dalla mancanza di un vaccino e l'assenza di una specifica terapia antivirale. Inoltre, una descrizione precisa degli eventi molecolari che si verificano durante l'infezione del sistema nervoso centrale (SNC) è ancora carente dal osservazioni principalmente derivano dalla autopsia dei bambini infetti. Diversi modelli animali, come macaco rhesus CMV, sono stati sviluppati e importanti conoscenze CMV patogenesi nel SNC. Tuttavia, nonostante la vicinanza evolutiva con gli esseri umani, questo modello è stata limitata dalla procedura di inoculazione intracranica usato per infettare gli animali e controistently indurre infezione del SNC. Inoltre, considerazioni etiche hanno promosso lo sviluppo di modelli alternativi, tra i quali l'infezione neonatale di topi appena nati con citomegalovirus topo (MCMV) ha recentemente portato a significativi progressi. Ad esempio, è stato segnalato che l'iniezione intraperitoneale di MCMV a Balb / c neonati porta all'infezione di neuroni e cellule gliali in aree specifiche del cervello. Questi risultati suggeriscono che l'inoculazione sperimentale di topi potrebbe ricapitolare i deficit indotti da HCMV nei bambini. Tuttavia, un'analisi dinamica di MCMV infezione di neonati è di difficile esecuzione a causa classica metodologia richiede il sacrificio di un numero significativo di animali a differenti tempi di analizzare il carico virale e / o parametri immuno-correlati. Per aggirare questo ostacolo e permettere future indagini di animali mutanti rari, abbiamo applicato nella tecnologia di imaging in vivo per eseguire analisi in tempo-corso della viral disseminazione nel cervello a seguito di iniezione periferica di un MCMV ricombinante esprimente luciferasi di C57BL / 6 neonati.
Introduzione
Citomegalovirus umano (HCMV/HHV-5) è un membro della famiglia di β-herpesvirus. HCMV è altamente prevalente, patogeno opportunista che di solito è acquisito durante primi anni di vita come un'infezione asintomatica 1. Come tutti i virus erpetici, HCMV persiste per tutta la vita dell'ospite cui sistema immunitario strettamente controlla la replicazione virale. Gli episodi di riattivazione virale per lo più si verificano in individui immunocompromessi, come i pazienti di trapianto che assumono farmaci per prevenire il rigetto del trapianto 2. Negli adulti, HCMV è anche stato collegato a glioblastomi 3. Inoltre, HCMV è un patogeno importante per i neonati con immunità immaturo 4-6. L'infezione primaria nello sviluppo del feto o il neonato, può avere gravi conseguenze. HCMV infezione è la causa infettiva più comune di difetti congeniti alla nascita e disturbi infantili nei paesi sviluppati. Si stima che l'incidenza di infezione da HCMV neonatale colpisce 0,5-1% of tutti i nati vivi tra i quali il 5-10% soffrirà di sintomi gravi, come la microcefalia o ipoplasia cerebellare. Inoltre, il 10% dei neonati con infezione virale subclinica sarà poi sviluppare sequele che porta a ritardo mentale, perdita, difetti visivi o il sequestro e l'epilessia 7,8 dell'udito.
Al contrario di altri herpesvirus umani come l'herpes simplex 1 (HSV-1/HHV-1) che possono essere inoculati nei topi attraverso diverse vie di iniezione 9, la replica citomegalovirus è specie specifico. Questa caratteristica ha gravemente ostacolato le indagini di HCMV patogenesi che vengono eseguite in diversi modelli animali (topo, ratto, cavia, scimmia rhesus) e le rispettive genuini CMVs ospite-specifici. Tutti CMVs presentano somiglianze significative dimensioni del genoma e organizzazione, tropismo tissutale e regolazione dell'espressione genica. Hanno anche indurre patologie simili nei loro rispettivi host. Nonostante la diversità genomica esseretween HCMV e mouse citomegalovirus (MCMV) (50% delle ORF presenti nel virus umano sono identificati nella murino CMV), il modello di topo ha recentemente dimostrato di essere vantaggioso, soprattutto perché ceppi mutanti possono essere testati per la loro capacità di controllare virale replicazione in vivo. Ciò ha portato ad una schermata genetico che ha consentito una stima del numero di geni di topo espresso allo stadio adulto che compongono il "resistome" per questo virus 10. Complessivamente, questo indica che i topi MCMV infettati rappresentano un interessante modello per lo studio delle interazioni ospite-virus negli adulti. L'esplorazione di infezione congenita da CMV è più complessa, perché le differenze di organizzazione strato placentare tra umani e topi compromettono la trasmissione materno-fetale dell'infezione virale nei topi. Recentemente, l'iniezione diretta di MCMV nella placenta il giorno 12.5 di gestazione ha permesso infezione del cervello di topi neonati che hanno portato alla compromissione dell'udito 11. Tuttavia, la maggior investigations ora usano l'iniezione intraperitoneale di 4-20 hr-vecchi neonati di fornire disseminazione sistemica virale che porta a infezione del cervello ematogena, un modello che è più rilevante di quella di una iniezione intracranica. Questo protocollo importanti conoscenze CMV patogenesi e più in particolare, è stato dimostrato che MCMV infezione di neonati risultati nella replicazione virale in cellule neuronali e gliali situate in focolai infiammatori che vengono infiltrati di cellule mononucleate come macrofagi 12. Questo rapporto descrive anche morfogenesi alterata del cervelletto accompagnato con diminuita proliferazione dei neuroni granulari e la migrazione e l'induzione di geni multipli interferone-stimolati. Il ruolo essenziale delle + cellule T CD8 per il controllo di MCMV nel sistema nervoso centrale è stato anche riportato dallo stesso gruppo 13. Un aspetto importante da considerare quando si analizza l'effetto patologica di un microbo è la dinamica del infettareione. Nel caso di MCMV, è particolarmente importante per esplorare e quantificare la progressione di diffusione virale nel cervello di sviluppo al fine di comprendere e anticipare la grandezza delle future lesioni neurobiologiche. Tradizionalmente, la quantificazione della progressione di un'infezione richiede il sacrificio regolare di animali infetti a titolo patogeno nei tessuti, come il cervello, che sono altrimenti inaccessibili. Questo tipo di protocollo viene ora contestata da necessario miglioramento del benessere degli animali e le 3R (ridurre, perfezionare, Replace) principi 14. Utilizzando tecnologie in vivo imaging può consentire una drastica riduzione del numero di animali che sono necessari in esperimenti di infezione in vivo. Qui, segnaliamo e descriviamo una analisi tempo-corso di diffusione virale nel cervello su intraperitoneale MCMV-Luc iniezione per neonati mouse. Utilizzando gli stessi animali, abbiamo seguito e monitorato in vivo i luoghi di intensa VIreplica ral durante un periodo di 2 settimane.
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Protocollo
1. Preparazione della sospensione virale
- Ottenere il ceppo Smith di MCMV esprimere luciferasi (MCMV-Luc 15) dal laboratorio di Ulrich Koszninowski. In questo ricombinante, il gene della luciferasi è inserito nel locus IE2 del genoma MCMV.
- Per amplificare MCMV-Luc, infettare un midollo linea di cellule stromali osseo murino (M2-10B4, ATCC # CRL-1972) con MCMV a diversa molteplicità di infezione (MOI, 0,001-1) 16. Per questo, aggiungere virus di cellule coltivate in mezzo privo di siero a 37 ° C. Dopo un'ora, rimuovere il supernatante e sostituirlo con DMEM supplementato con 10% siero fetale di vitello (FCS). Cinque giorni dopo, raccogliere il terreno di coltura e di conservare delle aliquote a -80 ° C fino a nuovo uso.
- Titolazione della sospensione virale mediante test placca.
- Dividere 3T3 (ATCC # CRL-1658) in una piastra a 24 a 40.000 cellule / pozzetto in 1 ml di DMEM supplementato con 10% FCS contenente penicillina (200 UI / ml) e steptomycin (200 mg / ml) E incubare 24 ore a 37 ° C.
- Preparare diluizioni seriali (10 -1 a 10 -8) di una aliquota di MCMV sospensione in DMEM e infettare cellule bersaglio (3T3) con 200 ml di diluizione dopo rimuovere coltura cellulare. Incubare per 1 ora a 37 ° C. Aggiungere 1 ml di Top Medium (DMEM 3% FCS, 2% (v / v) gentamicina, 200 IU / ml di penicillina, 200 mg / ml streptomicina, 8 g / L Carbossimetilcellulosa) e incubare 5 giorni a 37 ° C.
- Fissare le cellule aggiungendo 200 microlitri 10% di formaldeide (diluizione della formaldeide con acqua dovrebbe essere fatto in una cappa chimica per evitare inalazioni tossiche) in ciascun pozzetto e incubando 6 ore a temperatura ambiente. Togliere terreno di coltura + fissatore pipettando fuori e aggiungere 200 kit di colorazione delle cellule microlitri (1% di cristallo viola (w / v) in etanolo al 20%). Prima dell'uso, diluire 1 parte con 9 parti di acqua Milli-Q. Incubare 2 minuti a temperatura ambiente, lavare la piastra 3-4x immergendola in acqua, lasciate asciugare e contare il numero di placche con un binocolo.
- Diluire MCMV-Luc in DMEM per ottenere 50 PFUs in 50 microlitri e lasciare in ghiaccio fino a nuovo uso. Utilizzando inoculums virali più elevate induce letalità prima che i neonati raggiungano 2-3 settimane di età. Nella nostra esperienza, 500 PFUs causato mortalità nel neonato ogni 5 a 7 giorni dopo l'iniezione.
2. Iniezione di neonati
- Quando i neonati (4-20 hr-topi) sono disponibili, manipolare la lettiera e le feci della gabbia con i guanti prima di maneggiare con cura i cuccioli per evitare la contaminazione con gli odori "estranei" che sottolineare la madre e indurre il rigetto dei cuccioli .
- Eseguire un'iniezione intraperitoneale utilizzando una siringa da insulina (29 G) come mostrato nella Figura 1A. Tenere il neonato con la pelle dorsale. Con il lato ventrale, introdurre l'ago sotto la zampa anteriore e spingere delicatamente per via sottocutanea per raggiungere la cavità peritoneale (un po 'sotto l'ombelico). Al momento Iniettare 1% Blu di metilene diluito in DPBS e monitoriamo la sopravvivenza di practice la tecnica prima di eseguire le infezioni virali. Dal blu di metilene è chiaramente visibile durante il processo di iniezione, si consiglia di eseguire questa iniezione di "allenamento" prima di garantire un'adeguata distribuzione della sospensione virale nella cavità intraperitoneale.
- Eliminare le gocce di sangue molto piccoli che possono sorgere e posizionare il nuovo neonato nella gabbia.
3. Imaging in vivo
- Il giorno 7, di gestire i neonati con la stessa cautele come accennato in precedenza. Iniettare per via intraperitoneale una miscela di anestetici (4 mg / ml di ketamina, 0,8 mg / ml xilazina) e luciferina (0,15 mg / g di peso corporeo) in 50 microlitri in ciascun animale. Peso medio corporeo degli animali è di 1-2 g e la dose di anestetici per animale è: ketamina 40 mcg, xylazina 8 mcg Attendere 12-15 minuti fino a quando luciferina raggiunge il suo massimo di emissione. Questo deve essere determinato in anticipo e dipende dal provider luciferina e il sistema di imaging utilizzato.
- Mentre i cuccioli sono anesthetized, le tag per l'identificazione futuro e raccogliere un piccolo pezzo di tessuto che può quindi essere utilizzato per future genotipizzazione se si utilizzano animali mutanti.
- Collocare i cuccioli nel sistema di imaging ed eseguire acquisizione della luce emessa dal corpo intero. Sette giorni dopo l'infezione, il virus si è replicato in numerose copie negli organi bersaglio come fegato, reni, polmoni e delle ghiandole salivari, pertanto, la durata dell'esposizione dovrebbe essere breve. Nel nostro caso, eseguiamo l'acquisizione per 10 a 20 secondi (Figura 1B). La piattaforma nella camera di acquisizione del dispositivo di imaging deve essere riscaldato per evitare un eccessivo raffreddamento della temperatura corporea degli animali anestetizzati. Inoltre, è utile per ottenere immagini a bassa risoluzione di vari animali all'interno di un ciclo di acquisizione e poi, risalire la piattaforma più vicino alla lente della fotocamera in modo da concentrarsi su una parte di un particolare animale o di un organo isolato dopo la dissezione. Il software deve consentire rapidi cambiamentidei parametri (tempo di esposizione, distanza campione / obiettivo, sensibilità), la quantificazione di regioni definite di interesse e il futuro di esportazione di immagini istantanee.
- Per acquisire segnale luminoso da solo la testa, coprire il corpo dei neonati sdraiato lateralmente con una spessa, carta scura che maschera i fotoni emessi al livello degli organi dove avviene la replicazione virale elevata (fegato, polmoni, ghiandole salivari) ed effettuare acquisizione di 5 a 10 min (Figura 1C). Eseguire acquisizione del lato opposto dell'animale nelle stesse condizioni.
- Reintrodurre i cuccioli nella gabbia e posizionare una lampada riscaldante in alto per evitare un eccessivo raffreddamento dei neonati anestetizzati. Monitorare regolarmente il recupero post-anestetico. Con la dose indicata, anestesia attualmente dura 30 min.
- Ripetere la stessa procedura nei giorni 9, 11 e 14. Nei giorni 11 e 14, modificare la dose di anestetici (6 mg / ml di ketamina, 1,2 mg / ml xylazina).
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Risultati
Un esperimento rappresentativo è illustrato in Figura 1. A seguito di iniezione intraperitoneale di 50 PFUs di MCMV-Luc (Pannello A mostra una iniezione simile esercitata con blu di metilene di visualizzare via sottocutanea dell'ago), neonati sono stati anestetizzati e ricevuti simultaneamente 0,3 mg del substrato di luciferasi (Luciferin, compasso). Quindici minuti dopo, gli animali sono stati posti lato ventrale nella camera di acquisizione del IVIS 50 (In Vivo Imaging System, calibro) e la luce e...
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Discussione
Utilizzando la tecnologia di imaging in vivo per monitorare MCMV-Luc diffusione in topi neonati, siamo stati in grado di osservare la diffusione virale nel cervello di animali mutanti, al contrario di wild-type. Ulteriore dissezione dell'animale e di imaging ex vivo del cervello ha confermato la presenza del virus luminescente nel sistema nervoso centrale. Inoltre, abbiamo anche effettuato immunoistochimica (non mostrato) su sezioni sottili cerebrali con un anticorpo specifico per la prote...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano assenza di competizione interesse finanziario.
Dichiarazione etica
Gli animali sono stati mantenuti in condizioni esenti da organismi patogeni nella funzione di cura degli animali della Institut d'Immunologie et d'Hématologie. Manipolazione dei topi e delle procedure sperimentali sono state condotte in conformità con la legge francese per la protezione di animali da laboratorio. La procedura è stata approvata dal servizio veterinario della Prefettura du Bas-Rhin (Francia) con il numero di autorizzazione A-67-345.
Ringraziamenti
Ringraziamo Lee Tuddenham (IBMC, Strasburgo) per amplificare e titolazione MCMV-Luc e Thomas Baumert (INSERM U748, Strasburgo) per il permesso di utilizzare la struttura animale dell'Istituto di Virologia. Il sostegno finanziario da INSERM, Université de Strasbourg e Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-MIEN-005-01) è riconosciuto. La partecipazione iniziale di Sonia Beroud e Laetitia Lelieur durante la loro progetto Master è inoltre riconosciuto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagent/Material | |||
| DMEM | Fisher Scientific | W3523A | |
| Blu di metilene | Sigma Aldrich | 319112 | |
| Aghi per insulina | VWR | 613-4897 | |
| Ketamina | CentraVet | Ket 201 | |
| Xilazina/Vetranal | Sigma Aldrich | 46995 | |
| DPBS | DUTSCHER | P0436500 | |
| Luciferin Caliper | 760504 | ||
| gentamicina | Sigma Aldrich | G1272 | |
| penicillina/streptomicina | Gibco | 15070 | |
| carbossimetilcellulosa | Sigma | Aldrich C4888 | |
| formaldeide | Sigma Aldrich | F8775 | |
| cristallo viola | Sigma Aldrich | C3886 | |
| Equipment | |||
| IVIS 50 | Caliper/Perkin Elmer |
Riferimenti
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