La manipolazione genetica del topo sviluppo dell&#39;ipotalamo attraverso<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

Sommario

Nonostante l'importanza funzionale e mediche dell'ipotalamo, In utero Manipolazione genetica del suo sviluppo è stato raramente tentata. Mostriamo una procedura dettagliata per In utero Elettroporazione nell'ipotalamo mouse e mostrano risultati rappresentativi (regionale) trasfezione ipotalamo totale e parziale.

Abstract

Modificazione genetica di specifiche regioni del cervello dei mammiferi è sviluppare un approccio sperimentale molto potente. Tuttavia, generando nuovi mutanti di topo è spesso frustrante lentezza. È stato dimostrato che l'accesso al cervello di sviluppo del mouse in utero con ragionevole sopravvivenza post-operatoria è possibile. Ancora, risultati con questa procedura sono stati riportati quasi esclusivamente per la parte più superficiale e facilmente accessibile del cervello di sviluppo, cioè la corteccia. Il talamo, una regione stretto e più mediale, è dimostrato più difficile da bersaglio. Trasfezione in nuclei più profondo, specialmente quelli dell'ipotalamo, è forse il risultato più impegnative e, pertanto, molto pochi sono stati segnalati. Qui mostriamo una procedura per individuare l'intera neuroepitelio ipotalamica o parte di essa (regioni ipotalamiche) per trasfezione mediante elettroporazione. Le chiavi del nostro approccio sono più volte narcosi, l'iniezione in tHird ventricolo, e tipo e posizionamento degli elettrodi appropriata. Inoltre, vi mostriamo i risultati di targeting e la successiva analisi istologica del nucleo ipotalamico più incassata, il corpo mammillary.

Introduzione

Manipolazione genetica del cervello di topo embrionale è un approccio preferito per conoscere regolazione dello sviluppo. La generazione di linee mutanti topo però è lento e costoso. Un metodo efficace per introdurre specifici cambiamenti genetici nello sviluppo di neuroni del cervello dei mammiferi è elettroporazione in utero. In sostanza, la tecnica consiste transfecting DNA nel cervello embrionale neuroepithelium mediante impulsi elettrici, consentendo quindi l'embrione di sopravvivere per un certo periodo di tempo, raccogliere il cervello e li esamini per possibili romanzo, fenotipi informativi. In questo modo, l'sperimentatore può verificare ipo....

Protocollo

1. Preparazione del DNA e vetro Micropipette per Iniezione

1. Buone micropipette di vetro di qualità sono essenziali per ridurre il tasso iniziale aborto elevato a causa della perdita di liquido amniotico. La procedura di tirare micropipette di vetro è stato ben documentato ^13,18,25. Uso 1.2 mm di diametro capillari tirato in un convenzionale Sutter P-97 dispositivo con le impostazioni P = 500; calore = 300; Pull = 40; Velocità = 50; Tempo = 50. Montare l'estrattore con 3 millimetri filamenti "di valle" (Sutter Instrument FT330B). Le due millimetri filamenti dimensioni hanno prodotto per noi i risultati meno soddisfacenti. D'altra parte, sm....

Risultati

La maggior parte dei neuroni dell'ipotalamo sono nati tra E11.5 a E15.2, secondo l'analisi nascita-dating nel ratto ²⁶ tradotto nella po 'più breve di sviluppo del mouse ^27,28. Il picco della neurogenesi ipotalamica è raggiunta a E12.5 ^29-31. Conseguentemente, all'età trasfezione scelto per questo studio (E12.5), una grande proporzione di neuroni ipotalamici può essere etichettata ad ogni dato livello rostro-caudale.

Analisi alla E18.5 su sezi.......

Discussione

Circa l'anestesia: Poiché elettroporazione in utero nell'ipotalamo può essere tecnicamente ardua e richiedono tempi più lunghi narcosi, preferiamo indurre e mantenere l'anestesia mediante somministrazione di una miscela di ossigeno e isoflurano. Nella nostra esperienza, gli animali possono rimanere adeguatamente anestetizzato in questo modo, per periodi fino a un'ora almeno, la ripresa della madre è molto veloce, e la sopravvivenza dell'embrione migliorata. Altri approcci per l'anestesia.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
			REAGENTS
Acepromazine	Sanofi GmbH		anestetico
Isoflurano	Baxter	HDG9623	anestetico
Ketamin	Pharma GmbH		anestetico
Fast Green	Fluka	44715
Rimadyl	Pfizer		antinfiammatorio non steroideo
Braunoderm Braun		3887138	tampone povidone-iodio
fosfato soluzione salina PBS	Gibco	14190
Temgesic (buprenorfina)	Essex Pharma		oppioide analgesico
unguento per gli occhi	Pan-Ophtal	7136926
Xilazina	Bayer
			EQUIPMENT
Dispositivo anestetico Komesaroff Mark-5	Medical Developments Australia	ACN 004 903 682
Estrattore capillare P-97	Sutter Instrument Co.	P-97
Presstome	Precisionary Instr.	VF-300	Dispositivo di tipo vibratomo
Microscopio confocale	Zeiss	LSM700
Criostato	Leica	CM3050S
Elettroporatore	Nepa Gene Co. Ltd.	CUY21EDIT
Elettrodo 1	Nepa Gene Co. Ltd.	CUY550-10	Elettrodo ad ago in acciaio inox, punta 10 mm, diametro 0,5 mm.
Elettrodo 2	Nepa Gene Co., Ltd.	CUY700P4L	Coperchio Piastra rotonda in platino diametro 4 mm
Sorgente di luce fredda in fibra ottica	Leica	KL2500 LCD&	nbsp;
Capillari in vetro	Harvard Apparatus	GC120T-15	1,2 mm O.D. x 0,94 mm I.D.
sterilizzatore a microsfere di vetro	Fine Science Tools	FST250
Termoforo	Harvard Apparatus	py872-5272
Dispositivo di iniezione	World Precision Instruments	Pompa pneumatica Pico PV820
Sutura con filo di sutura rivestita in Vicryl	Ethicon	V4914	peritoneale
Thr. Supramid	Serag Wiessner	TO07171L	Sutura cutanea

Sutura