La manipolazione genetica del topo sviluppo dell'ipotalamo attraverso In utero Elettroporazione

Summary

Nonostante l'importanza funzionale e mediche dell'ipotalamo, In utero Manipolazione genetica del suo sviluppo è stato raramente tentata. Mostriamo una procedura dettagliata per In utero Elettroporazione nell'ipotalamo mouse e mostrano risultati rappresentativi (regionale) trasfezione ipotalamo totale e parziale.

Abstract

Modificazione genetica di specifiche regioni del cervello dei mammiferi è sviluppare un approccio sperimentale molto potente. Tuttavia, generando nuovi mutanti di topo è spesso frustrante lentezza. È stato dimostrato che l'accesso al cervello di sviluppo del mouse in utero con ragionevole sopravvivenza post-operatoria è possibile. Ancora, risultati con questa procedura sono stati riportati quasi esclusivamente per la parte più superficiale e facilmente accessibile del cervello di sviluppo, cioè la corteccia. Il talamo, una regione stretto e più mediale, è dimostrato più difficile da bersaglio. Trasfezione in nuclei più profondo, specialmente quelli dell'ipotalamo, è forse il risultato più impegnative e, pertanto, molto pochi sono stati segnalati. Qui mostriamo una procedura per individuare l'intera neuroepitelio ipotalamica o parte di essa (regioni ipotalamiche) per trasfezione mediante elettroporazione. Le chiavi del nostro approccio sono più volte narcosi, l'iniezione in tHird ventricolo, e tipo e posizionamento degli elettrodi appropriata. Inoltre, vi mostriamo i risultati di targeting e la successiva analisi istologica del nucleo ipotalamico più incassata, il corpo mammillary.

Introduction

Manipolazione genetica del cervello di topo embrionale è un approccio preferito per conoscere regolazione dello sviluppo. La generazione di linee mutanti topo però è lento e costoso. Un metodo efficace per introdurre specifici cambiamenti genetici nello sviluppo di neuroni del cervello dei mammiferi è elettroporazione in utero. In sostanza, la tecnica consiste transfecting DNA nel cervello embrionale neuroepithelium mediante impulsi elettrici, consentendo quindi l'embrione di sopravvivere per un certo periodo di tempo, raccogliere il cervello e li esamini per possibili romanzo, fenotipi informativi. In questo modo, l'sperimentatore può verificare ipotesi quasi immediatamente senza i lunghi periodi di attesa necessari per la produzione di mutanti di topo.

Trasfezione di DNA in via di sviluppo è iniziato con embrioni in elettroporazione ovo su embrioni di pollo ^1. L'essenziale proof-of-concept per il mouse è stata eseguita in cultura ^{2. Questo è stato presto seguito dalle prime descrizioni della tecnica del mouse in utero 3,4.}

Il problema principale è quello di transfettare il cervello di embrioni in via di sviluppo in utero senza ucciderli o della madre. Apprendimento per eseguire l'intervento necessario (laparotomia, iniezione, elettroporazione) richiede un lungo periodo di formazione. Una volta che l'intervento chirurgico è stato masterizzato al punto in cui il rapporto di sopravvivenza degli embrioni è accettabile, la prossima domanda chiave è: quali strutture cerebrali sono accessibili? Non a caso, i primi documenti pubblicati mostrano risultati ottenuti con elettroporazione in utero focalizzati su sviluppo corticale ^5-9. Questo è ancora vero per la maggior parte delle pubblicazioni utilizzando questa tecnica, poiché la regione del cervello di sviluppo del mouse più accessibile per procedure chirurgiche è la corteccia (Figura 1). La procedura per elettroporazione in utero nella corteccia è stata descrittain stampa ¹⁰ e in video ^11-14. Una modifica della tecnica può essere utilizzata per indirizzare una parte ventrale del telencefalo, i gangli della base ^15.

Al di là del telencefalo, il diencefalo (classicamente suddiviso in talamo e ipotalamo) è una regione del prosencefalo più difficile da raggiungere. Un piccolo numero di documenti di report di targeting della sua parte dorsale e più accessibile, il talamo ^16-19.

L'ipotalamo è la parte più ventrale del prosencefalo, quindi quello localizzato più profondamente dalla superficie dorsale (corteccia) (Figura 1). Questa regione rimane una sfida difficile per i ricercatori impegnati a manipolare geneticamente il cervello di topo in utero. A nostra conoscenza, solo pochissimi articoli riferire sui risultati di in utero trasfezione nell'ipotalamo del mouse ^20,21. Tuttavia, l'importanza funzionale dell'ipotalamo cannot essere sottovalutata, in quanto regola i comportamenti come il mangiare e il bere, l'accoppiamento, l'allevamento e la genitorialità ^22. Inoltre, alterazioni dello sviluppo dell'ipotalamo contribuiscono ad originare in seguito a condizioni di vita come l'obesità, l'ipertensione, il diabete e la pubertà precoce ^23. Essere in grado di modificare geneticamente l'ipotalamo durante lo sviluppo potrebbe fornire uno strumento molto potente per capirlo.

Il protocollo chirurgico di base per la laparotomia di topo gravide che utilizziamo qui è simile a quella utilizzata in altri protocolli ^11,13,14,24. Noi li descrivono brevemente qui per completezza. Chiave del nostro procedimento, invece, sono il tipo di anestesia, il luogo di iniezione, del tipo di elettrodi e l'inserimento e la posizione dell'elettrodo positivo rispetto alla testa del embrione. Preferiamo indurre e mantenere l'anestesia per inalazione gas su semplice anestesia intraperitoneale, poiché il primo consente l'un po 'più lunghi periodi di narcosi necessari per un intervento chirurgico difficile. Risultati inalazione isoflurano in veloce recupero dall'anestesia, dal momento che di solito la madre dimostra un comportamento normale già minuti dopo l'intervento chirurgico. Il più facile punto di iniezione della soluzione di DNA con la micropipetta di vetro è il ventricolo laterale, che però è completamente inadatto per ipotalamo elettroporazione. Iniezione diretta del terzo ventricolo è infatti cruciale per indirizzare le strutture diencefaliche profonde. È possibile trasfettare all'ipotalamo da E12.0 E12.5 o con elettrodi standard, off-the-shelf. Abbiamo trovato alcuni degli elettrodi fabbricati da Nepa Gene (Chiba, Giappone) particolarmente adatta a questo scopo.

Con la nostra procedura otteniamo trasfezione di tutta neuroepitelio ipotalamica o parziale, trasfezione regionale a seconda dell'orientamento elettrodo. Qui mostriamo la tecnica transfettando corpo mammillary, discutibilmenteil più profondo e incasso di tutti i nuclei ipotalamici. Inoltre, mostriamo analisi istologica dettagliata delle cellule trasfettate giù al livello cellulare di risoluzione.

Un confronto di elettroporazione in utero ad altri procedimenti di trasfezione sviluppo cerebrale topo in utero può essere trovata nella sezione di discussione.

Protocol

1. Preparazione del DNA e vetro Micropipette per Iniezione

1. Buone micropipette di vetro di qualità sono essenziali per ridurre il tasso iniziale aborto elevato a causa della perdita di liquido amniotico. La procedura di tirare micropipette di vetro è stato ben documentato ^13,18,25. Uso 1.2 mm di diametro capillari tirato in un convenzionale Sutter P-97 dispositivo con le impostazioni P = 500; calore = 300; Pull = 40; Velocità = 50; Tempo = 50. Montare l'estrattore con 3 millimetri filamenti "di valle" (Sutter Instrument FT330B). Le due millimetri filamenti dimensioni hanno prodotto per noi i risultati meno soddisfacenti. D'altra parte, smussatura della micropipetta punte non sembra migliorare i risultati per noi.
2. Sciogliere purificato, DNA plasmidico privo di endotossine in PBS (Cell Culture Grade) contenente 0,1% Verde fast ad una concentrazione finale di 1 a 2 mg / mL. Il oVerde renderà la soluzione iniettata visibile nel ventricolo cerebrale embrionale.
3. Carico 10 microlitri della soluzione di DNA nel micropipetta di vetro.
4. Collegare la micropipetta di vetro al sistema di iniezione (pompa Pico) o bocca pipetta.

2. Anestesia

Preparare il tavolo chirurgico con una piastra elettrica e gli strumenti chirurgici. Accendere le sorgenti di luce fredda per facilitare la visualizzazione degli embrioni. Disinfettare gli strumenti chirurgici utilizzando per esempio una perlina di vetro sterilizzatore.

Sono possibili tre diverse procedure di anestesia per questo protocollo (vedi discussione). Qui descriveremo quello che consideriamo il meglio, utilizzando inalazione isoflurano per l'induzione dell'anestesia (portata 0,5 l / min) e di manutenzione (portata 1 l / min).

1. Introdurre il mouse incinta in un piccolo trasparente (così il mouse rimane visibile) contenitore collegato al Komesaroff Mark 5 anestetico dispositivo da un breve tratto di tubo.
2. Riempire il vaporizzatore con isoflurano, quindi aprire la bombola di ossigeno collegato al dispositivo. Saltare uno o due impulsi di isoflUrane / ossigeno (0,5 l / min) nel contenitore tenendo premuto il mouse e guardare per narcosi a prendere piede
3. Prendete il mouse fuori, coprire gli occhi con unguento per evitare che si secchi e si adattano la maschera anestesia flusso sulla sua testa immediatamente.

3. Laparotomia

1. Posizionare il mouse a pancia in su sul pad riscaldamento (altrimenti la sua temperatura corporea scende molto velocemente, diminuendo le possibilità di recupero) e fissare il suo corpo in posizione fissando le sue quattro gambe ai lati con del nastro adesivo. Valutare la profondità dell'anestesia controllando per la perdita di risposta alla stimolazione riflessa (es. punta o la coda pizzico con una forte pressione).
2. Radersi la superficie addominale e disinfettarlo con il iodophorpovidone-iodio (Braunoderm).
3. Effettuare una incisione longitudinale (lungo da 1 a 1,5 cm) sulla cute addominale. Poi tagliare il peritoneo. Posizionare garza di cotone intorno alla incisione. Fai un corno uterino visibile ed estrarlo con cautela con una pinza smussato sulla PBS-risciacquato gauze. Risciacquare dell'utero con PBS molto spesso per mantenerlo sempre inumidito (Figure 2A e 2B). Durante l'intera procedura di evitare di tirare il mesometrio o dell'utero stretto, poiché l'alta pressione all'interno dell'utero trasmetterà all'embrione aumentando le probabilità di perdita di fluido in fase di iniezione con conseguente aborto.

4. Iniezione DNA nel ventricolo cerebrale

1. Tenere l'utero in modo tale che i ventricoli cerebrali possono essere visualizzati. Non estesamente riposizionare un embrione che si trova in una posizione sfavorevole - questo aumenta solo le probabilità di aborto.
2. Guardando la testa dell'embrione dall'alto, localizzare visivamente il gap o fessura tra gli emisferi corticali destro e sinistro. Gli emisferi sono facili da distinguere e ventricoli laterali al loro interno (per non essere presi di mira) di solito possono essere percepite come forme un po 'più scuri. Se un embrione è risultato essere perfettamente orientato per l'iniezione del DNA (Figures 2C e 2D), è possibile perforare la parete uterina e entrano nel terzo ventricolo in una volta. Tenere la micropipetta di vetro a 45 ° rispetto alla parete uterina e puntura alla fine rostrale del divario tra emisferi corticali, penetrando per circa 1 mm. In questo modo la punta della micropipetta di vetro entrerà nel terzo ventricolo del cervello (non il ventricolo laterale) (Figure 2C e 2D). In embrioni meno favorevolmente orientati è utile prima perforare la parete uterina (sempre a 45 °) in prossimità della testa embrionale, posizionare la punta micropipetta nella giusta posizione tra gli emisferi corticali e solo allora perforare il cervello. Iniettare circa 1 ml di soluzione di DNA nel terzo ventricolo (una buona iniezione riempie il ventricolo con liquido verde). Ripetere la stessa procedura con tutti gli embrioni di un corno dell'utero. Questo permette un certo tempo per la soluzione di DNA per mescolare uniformemente con il fluido ventricolare e raggiungere il entire neuroepitelio.

5. Targeting l'ipotalamo per elettroporazione

1. Accendere il elettroporatore e regolare le impostazioni in base all'età embrionale (per E12.5 usiamo 5 impulsi a onda quadra, 50 V, 50 msec ON/950 msec OFF). Utilizzare come polo positivo all'elettrodo ago in acciaio inossidabile (CUY550-10) e come polo negativo di un elettrodo piatto rotondo (CUY700P4L). (È importante che gli elettrodi sono più piccoli l'embrione, poiché altrimenti la corrente scorre dietro l'embrione ma non attraverso esso.)
2. Selezionare per elettroporazione quegli embrioni la cui parte dorsale è alto (cioè rivolta verso lo sperimentatore) (come la maggior parte di loro sono), e scartare quelle il cui orientamento non è favorevole. Ora è possibile toccare l'utero con le dita etanolo-disinfettate o con i guanti. Tenendo dell'utero con una pinza, tuttavia, potrebbe interferire con il flusso di corrente durante elettroporazione.
3. Perforare la parete uterina per la testa dell'embrione tra il amnsac iotico e la placenta dalla spinta verso il basso attraverso di essa con la punta dell'elettrodo dell'ago. Utilizzare il dito indice dell'altra mano come blocco di spinta. Circa 5 mm della punta dell'elettrodo deve essere ora tra il sacco amniotico e la parete uterina, circa al livello del mesencefalo (figure 2E e 2F). Ricordate che questo è il "mira elettrodo", quindi la sua posizione determinerà quale è più probabile ottenere trasfettate parte del neuroepitelio ipotalamico. L'embrione deve essere molto gentilmente "spremuto" tra gli elettrodi.
4. Con l'altra mano, posizionare l'elettrodo piatto tondo esterna della parete dell'utero sul lato opposto della testa dell'embrione (figure 2E e 2G).
5. Utilizzare l'interruttore a pedale per applicare tensione (50 V, 50 ms ON, 950 ms OFF, 5 impulsi a onda quadra).
6. Tirare lentamente l'elettrodo ad ago fuori dell'utero, mentre trattenendo l'utero con il dito indice dell'altra mano - se amniotic liquido viene perso attraverso la parete forata, di solito l'embrione subirà aborto. Ripetere la procedura con tutti gli embrioni.
7. Ritorna il corno dell'utero nell'addome e ripetere l'iniezione ed elettroporazione nel corno residuo.

6. Completamento della Chirurgia

1. Dopo l'iniezione ed elettroporazione di tutti gli embrioni, posizionare l'utero torna in addome con molta attenzione, posizionato esattamente come erano prima e umide cavità peritoneale con soluzione fisiologica prima di chiuderlo.
2. Sutura del peritoneo con catgut (Vicryl Polyglactin 910, 5-0, Ethicon V4914). Per la chiusura della pelle uso "interruppe stitch" methodwith una sutura più resistente (Supramid Nylon, 6-0, Serag Wiessner TO 07171L).
3. Disinfettare la superficie dell'addome con povidone-iodio (Braunoderm) e iniettare un non-steroidei anti-infiammatori per via sottocutanea (ad esempio 100 ml di una soluzione 1:10 di Rimadyl in 0.9% NaCl) o, meglio ancora, un oppioide come buprenorphine (Temgesic, da 0.05 a 0.1 mg / kg di peso corporeo in 0.9% NaCl) per alleviare il dolore.
4. Rimuovere la madre dalla macchina anestetica e metterlo in una gabbia che è riscaldata da una piastra elettrica. Monitorare il mouse continuamente fino a quando non è completamente recuperato dal anestesia. Successivamente, controllare gli animali ogni giorno per assicurare che si stanno riprendendo dalla procedura senza alcun segno di infezione o dolore.

7. Analisi dei risultati

1. Raccogliere gli embrioni (o postnatals) secondo il giorno desiderato di analisi. Topi postnatale (1-2 giorni di età) vengono uccisi per decapitazione.
2. Separare ogni embrione secondo il precedente elettroporazione annotazione. Sezionare il cervello allo stereomicroscopio e controllare al microscopio per segnale fluorescente verde (GFP dal reporter) nella regione appropriata.
3. Il cervello selezionato può essere analizzato "fresco": fissare il tessuto per un breve periodo in paraformaldeide al 4% e incorporare nel agarosio 4% o in gelatina-albumin, poi sezione su un dispositivo vibratomo-type (Figura 3). Per l'analisi immunoistochimica dettagliata (Figura 4), ​​crio-proteggere il cervello in soluzione di saccarosio al 30%, incorporare nel montaggio Ottobre medio (Tissue Tek) poi tagliare 20 sezioni micron in un criostato.

Results

La maggior parte dei neuroni dell'ipotalamo sono nati tra E11.5 a E15.2, secondo l'analisi nascita-dating nel ratto ²⁶ tradotto nella po 'più breve di sviluppo del mouse ^27,28. Il picco della neurogenesi ipotalamica è raggiunta a E12.5 ^29-31. Conseguentemente, all'età trasfezione scelto per questo studio (E12.5), una grande proporzione di neuroni ipotalamici può essere etichettata ad ogni dato livello rostro-caudale.

Analisi alla E18.5 su sezioni vibratome-ti...

Discussion

Circa l'anestesia: Poiché elettroporazione in utero nell'ipotalamo può essere tecnicamente ardua e richiedono tempi più lunghi narcosi, preferiamo indurre e mantenere l'anestesia mediante somministrazione di una miscela di ossigeno e isoflurano. Nella nostra esperienza, gli animali possono rimanere adeguatamente anestetizzato in questo modo, per periodi fino a un'ora almeno, la ripresa della madre è molto veloce, e la sopravvivenza dell'embrione migliorata. Altri approcci per l'anestesia...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
Acepromazine	Sanofi GmbH		anestetico
Isoflurano	Baxter	HDG9623	anestetico
Ketamin	Pharma GmbH		anestetico
Fast Green	Fluka	44715
Rimadyl	Pfizer		antinfiammatorio non steroideo
Braunoderm Braun		3887138	tampone povidone-iodio
fosfato soluzione salina PBS	Gibco	14190
Temgesic (buprenorfina)	Essex Pharma		oppioide analgesico
unguento per gli occhi	Pan-Ophtal	7136926
Xilazina	Bayer
			EQUIPMENT
Dispositivo anestetico Komesaroff Mark-5	Medical Developments Australia	ACN 004 903 682
Estrattore capillare P-97	Sutter Instrument Co.	P-97
Presstome	Precisionary Instr.	VF-300	Dispositivo di tipo vibratomo
Microscopio confocale	Zeiss	LSM700
Criostato	Leica	CM3050S
Elettroporatore	Nepa Gene Co. Ltd.	CUY21EDIT
Elettrodo 1	Nepa Gene Co. Ltd.	CUY550-10	Elettrodo ad ago in acciaio inox, punta 10 mm, diametro 0,5 mm.
Elettrodo 2	Nepa Gene Co., Ltd.	CUY700P4L	Coperchio Piastra rotonda in platino diametro 4 mm
Sorgente di luce fredda in fibra ottica	Leica	KL2500 LCD&	nbsp;
Capillari in vetro	Harvard Apparatus	GC120T-15	1,2 mm O.D. x 0,94 mm I.D.
sterilizzatore a microsfere di vetro	Fine Science Tools	FST250
Termoforo	Harvard Apparatus	py872-5272
Dispositivo di iniezione	World Precision Instruments	Pompa pneumatica Pico PV820
Sutura con filo di sutura rivestita in Vicryl	Ethicon	V4914	peritoneale
Thr. Supramid	Serag Wiessner	TO07171L	Sutura cutanea