Procedure per la ricostituzione completa di un canale del potassio voltaggio-dipendenti prototipo nelle membrane lipidiche sono descritti. I canali ricostituiti sono adatti per saggi biochimici, registrazioni elettriche, screening ligando e studi cristallografici di elettroni. Questi metodi possono avere applicazioni generali agli studi strutturali e funzionali di altre proteine di membrana.
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Articolo metodologico
La ricostituzione di un canale Kv in membrane lipidiche per gli studi strutturali e funzionali
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Studiare l'interazione proteina-lipide in modo riduttivo, è necessario incorporare le proteine di membrana nelle membrane di composizione lipidica ben definita. Stiamo studiando gli effetti di gating lipidi-dipendenti in un potassio voltaggio-dipendenti (Kv) canale di prototipo, e abbiamo lavorato procedure dettagliate per ricostituire i canali in diversi sistemi a membrana. Nostre procedure ricostituzione tengono conto sia della fusione detergente indotta di vescicole e la fusione di proteina / detergente micelle con i lipidi / detergente micelle miste nonché l'importanza di raggiungere una distribuzione di equilibrio di lipidi tra le proteine / detergente / lipidi e il detersivo / lipidi micelle miste. I nostri dati suggeriscono che l'inserimento di canali nei vescicole lipidiche è relativamente casuale in orientamenti, e l'efficienza di ricostituzione è così alto che non rilevabili aggregati proteici sono stati osservati in esperimenti di frazionamento. Abbiamo utilizzato il ricostituired canali per determinare gli stati conformazionali dei canali in differenti lipidi, registrare attività elettrica di un piccolo numero di canali incorporate in bistrati lipidici planari, schermo per ligandi conformazione-specifici da una libreria peptidica fago visualizzato, e sostenere la crescita dei cristalli 2D dei canali in membrane. Le procedure descritte qui di ricostituzione possono essere adeguati per lo studio di altre proteine di membrana in doppi strati lipidici, in particolare per l'indagine degli effetti dei lipidi sui canali ionici voltaggio-dipendenti eucariotiche.
Introduzione
Celle scambiare materiali e informazioni con l'ambiente attraverso le funzioni delle proteine di membrana specifici 1. Le proteine di membrana nelle membrane cellulari funzionano come pompe, canali, recettori, enzimi intramembrane, linker e sostenitori strutturali attraverso le membrane. Le mutazioni che influenzano le proteine di membrana sono stati legati a molte malattie umane. Infatti, molte proteine di membrana sono stati gli obiettivi farmacologici primari perché sono importanti e facilmente accessibili nelle membrane cellulari. È quindi molto importante per comprendere la struttura e funzione di varie proteine di membrana nelle membran....
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Protocollo
1. Espressione e purificazione di KvAP Canale (Figura 1)
- Preparazione lavoro - Giorno 0
- Sciacquare i flaconi di vetro per la coltura batterica con acqua deionizzata (diH 2 O) e MilliQ H 2 O (MQH 2 O) per rimuovere tracce di detersivo da lavastoviglie generale.
- Autoclave 1000 ml di mezzo LB in 2.8 L Erlenmeyer (totale due litri cultura come un esempio qui). Bassa durezza dell'acqua è risultato essere importante per la coltura positiva dei batteri trasformati.
- Autoclave 100 ml di terreno LB in flaconi da 500 ml
- Trasforma 60 microlitri di cellule competenti XL1-Blue con 200 ng del pQE....
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Risultati
Il flusso generale degli esperimenti per purificare il canale KvAP in omogeneità biochimica è descritto nella Figura 1A. Esempi tipici durante l'espressione e la purificazione della proteina è mostrato nel gel SDS-PAGE in Figura 1B. La proteina dopo la purificazione IMAC è relativamente pura. La resa del canale KvAP è di circa 1,0 mg / Litro cultura.
Solubilizzazione delle vescicole lipidiche con detergenti deve essere elaborato per ciascuna coppia di li.......
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Discussione
La ricostituzione dei canali KvAP in diverse membrane è stata utilizzata in diversi studi 8-10. Seguendo l'idea di garantire la distribuzione dei lipidi tra detergenti / lipide micelle miste e le proteine / detergente / lipide micelle miste, siamo in grado di raggiungere quasi completa ricostituzione del KvAP nelle membrane in molto differenti lipidi. Ogni canale KvAP tetramerica bisogno ~ 100 molecole lipidiche per coprire pienamente il suo dominio transmembrana. Il requisito essenziale è permettere mo.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli studi sulla KvAP nel Jiang laboratorio hanno ottenuto un aiuto significativo dal laboratorio del Dr. Roderick MacKinnon presso la Rockefeller University. Un ringraziamento particolare va al Dott. Kathlynn Brown e Michael McQuire per i loro consigli e aiuto sui nostri esperimenti fago schermo. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal NIH (GM088745 e GM093271 a Q-XJ) e AHA (12IRG9400019 a Q-XJ).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tryptone | RPI Corp. | T60060 | |
| Estratto di lievito | RPI Corp. | Y20020 | |
| NaCl | Fisher | S271-3 | |
| Tris Base | RPI Corp. | T60040 | |
| Cloruro di potassio | Fisher | BP366-500 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltoside | Affymetrix | D322S | Sol-grade |
| n-Octyl-β-D-Glucoside | Affymetrix | O311 | Ana-grade |
| Aprotinin | RPI Corp. | A20550-0.05 | |
| Leupeptin | RPI Corp. | L22035-0.025 | |
| Pepstatina A | RPI Corp. | P30100-0.025 | |
| PMSF | SIGMA | P7626 | |
| Dnase I | Roche | 13407000 | |
| Bio-Bead SM-2 | Bio-Rad | 152-3920 | |
| HEPES | RPI Corp. | H75030 | |
| POPE | Avanti Polar Lipids | 850757C | |
| POPG | Avanti Polar Lipids | 840457C | |
| DOGS | Avanti Polar Lipids | 870314C | |
| DMPC | Avanti Polar Lipids | 850345C | |
| Biotin-DOPE | Avanti Polar Lipids | 870282C | |
| DOTAP | Avanti Polar Lipids | 890890C | |
| Perle di agarosio NeutrAvidin | Piercenet | 29200 | |
| Tubi per dialisi | Spectrum Laboratories, Inc | 132-570 | |
| Pentano | Fisher | R399-1 | |
| Decano | TCI America | D0011 | |
| MTS-PEG5000 | Toronto Research Cemicals | M266501 |
Riferimenti
- Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , 5th edition, Galand Science. New York. (2007).
- Lee, A. G. How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach. Mol. Biosyst. 1, 203(2005).
- Lee, A. G.
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Ristampe e permessi
