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Articolo metodologico

Flybar: Amministrazione alcol a Flies

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DOI:

10.3791/50442

⸱

18 maggio 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biological Science, Florida State University, 2Department of Biology and Biochemistry, Biology of Behavior Institute, University of Houston

In questo articolo

Sommario

Drosophila è emersa come sistema modello significativo per la dissezione delle basi cellulari e molecolari delle risposte comportamentali all'alcool. Qui vi presentiamo un protocollo per la raccolta di dati di sensibilità alcol in un contesto circadiano che può essere facilmente applicato ad altri esperimenti ed è particolarmente adatto per la ricerca di laurea.

Abstract

Moscerini della frutta (Drosophila melanogaster) sono un modello stabilito sia per la ricerca di alcol e di biologia circadiana. Recentemente, abbiamo dimostrato che l'orologio circadiano modula alcool sensibilità, ma non la formazione di tolleranza. Qui, descriviamo il nostro protocollo in dettaglio. L'alcol viene somministrato alle mosche con flybar. In questa configurazione, vapori di alcol saturo viene miscelato con aria umidificata in set proporzioni, e somministrato alle mosche in quattro tubi contemporaneamente. Le mosche sono allevati in condizioni standardizzate al fine di minimizzare la variazione tra le repliche. Tre giorni di età in linea di differenti genotipi o trattamenti vengono utilizzati per gli esperimenti, preferibilmente abbinando mosche di due diversi punti di tempo (ad esempio, CT 5 e CT 17) rendendo possibili confronti diretti. Durante l'esperimento, mosche sono esposti per 1 ora alla percentuale prestabilita del vapore di alcool e il numero di mosche che esporre la perdita del riflesso di raddrizzamento (Lorr) o sedzione sono conteggiati ogni 5 min. I dati possono essere analizzati utilizzando tre differenti approcci statistici. Il primo è quello di determinare il momento in cui il 50% delle mosche hanno perso il loro riflesso di raddrizzamento e utilizzare un analisi della varianza (ANOVA) per determinare se esistono differenze significative tra i punti temporali. Il secondo è quello di determinare le mosche percentuali che mostrano Lorr dopo un determinato numero di minuti, seguita da un'analisi ANOVA. L'ultimo metodo è quello di analizzare l'intera serie di volte con statistica multivariata. Il protocollo può essere utilizzato anche per esperimenti non circadiani o confronti tra i genotipi.

Introduzione

Drosophila melanogaster dimostrare risposte comportamentali bifasico all'alcool 1 che sono analoghi a risposte umane a questo farmaco 2,3. Dopo l'esposizione iniziale a basse concentrazioni di alcol, mosche mostra un aumento dell'attività locomotoria, sostituito da una mancanza di coordinazione motoria, la perdita del controllo posturale e raddrizzamento riflessi (perdita del riflesso di raddrizzamento: Lorr), e la sedazione (completa mancanza di attività motoria in risposta alla stimolazione meccanica) come l'esposizione all'alcol progredisce 4-9. L'orologio circadiano endogeno è un modulatore di forte sensibilità alcol e tossicità osservata in topi, ratti 10,11 12, 13 e nell'uomo. I recenti progressi nella ricerca Drosophila hanno mostrato l'orologio circadiano modula la sensibilità acuta da alcol, ma non l'alcol tolleranza 1. I potenti approcci genetici disponibili a Drosophila attraverso studi mutanti e manipolazioni transgeniche di spazialee l'espressione genica temporale fornire un sistema che consente rapidi progressi nell'identificare i meccanismi cellulari e molecolari alla base di comportamenti complessi. L'uso di Drosophila come strumento di indagine ha consentito progressi sostanziali nella comprensione di alcol neurobiologia che possono essere rapidamente tradotti ai mammiferi 14-16. Al fine di facilitare la comprensione dei meccanismi molecolari attraverso i quali l'orologio circadiano modula la sensibilità di alcol e di misurare uniformemente risposte comportamentali attraverso punti di tempo circadiani, un protocollo di somministrazione di alcol adatto per l'uso in condizioni di luce rossa fioca è richiesto. Per Drosophila, l'alcool può essere somministrato attraverso integrazione alimentare per esposizione cronica o affidabile attraverso amministrare alcol in forma di vapore per esposizioni acute. Qui, descriviamo un protocollo di somministrazione alcool adatto per la valutazione della modulazione circadiano di perdita-di-riflesso di raddrizzamento (Lorr) 1 nonchésedazione.

Le mosche sono trascinate con 12 ore: 12 cicli hr LD a temperatura costante e poi trasferiti in un regime di luce controllata per 2-5 giorni a seconda della questione sperimentale. Mosche sono esposti al vapore di etanolo in un dispositivo noto come flybar. In questo dispositivo, quantità controllate di aria vengono gorgogliare attraverso acqua e alcool; i vapori vengono poi mescolati e diretti in un alloggiamento flaconcino in linea. Ogni 5 min in linea sono segnati per il numero che non riesce a visualizzare raddrizzamento riflessi o sono diventati sedato. Percentuali Lorr per ogni punto di tempo vengono calcolati e confrontati tra i punti temporali circadiani o tra ceppi di mosche. La semplicità e l'affidabilità di consegna alcol con la consegna di alcol flybar combinato con le opzioni di analisi comportamentale offre un vantaggio significativo per gli esperimenti circadiani condotti in condizioni di oscurità.

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Protocollo

1. Assemblea della flybar

Motivazione e Panoramica: Il sistema è progettato per amministrare percentuali controllate di vapore di alcol per le mosche. Nota: La figura 1 fornisce una panoramica schematica del flybar set-up come descritto di seguito in tre fasi (assemblaggio del flusso d'aria, set-up della alcol e bottiglie d'acqua, e l'assemblaggio delle fiale di osservazione). In breve, un flusso d'aria costante è diviso in due frazioni che vengono gorgogliare attraverso alcool e acqua, rispettivamente mescolati e somministrati a 4 flaconcini di osservazione.

  1. Assemblea della Airflow
    1. Collegare un breve pezzo di tubo flessibile in silicone a uno edificio aria o con un aeratore acquario di generare un flusso d'aria costante e diviso utilizzando un connettore a Y. Collegare il primo ramo al regolatore di flusso d'aria che controlla la quantità totale di aria attraverso il sistema (tipicamente 1.000 ml / min per 4 flaconcini di osservazione).
    2. Inserire una rapida connettore nella seconda provettain modo che il flusso d'aria può essere interrotta all'inizio dell'esperimento senza influenzare il flusso d'aria calibrato. Aggiungere un connettore a Y e collegare ogni tubo ramificazione al regolatore flusso d'aria.
    3. Collegare il tubo ai regolatori di flusso d'aria e quindi collegare due metri del flusso d'aria.
  2. Set-up delle bottiglie di alcool e acqua
    1. Aggiungere tubo flessibile per l'uscita dei misuratori del flusso d'aria e inserire un tubo di vetro sottile (sezioni 1 pipette di vetro ml) con una curva a 90 ° in termine di ogni pezzo di tubo. Questo servirà come il flusso d'aria in ingresso nelle bottiglie di acqua e alcool.
    2. Mettere tappi di gomma con 2 fori attraverso di loro nelle bottiglie piene di alcool e acqua. Tenere entrambe le bottiglie ad una temperatura costante di 2 ° C superiore alla temperatura dell'aria ambiente con un bagno di acqua. Nei nostri esperimenti, la camera ambientale è mantenuta a 25 ° C, mentre il bagno d'acqua è a 27 ° C.
    3. Inserire la pipetta di vetro dritto per la air ingresso attraverso il tappo di gomma e si estendono nel liquido fino a circa 1 cm dal fondo della bottiglia.
    4. Inserire una sezione gomito di pipetta di vetro nel foro rimanente nel tappo di gomma fino alla fine del vetro è a filo con la parte inferiore del tappo all'interno della bottiglia. Inserire questa uscita dell'aria in un'altra lunghezza del tubo.
    5. Riunire i flussi d'aria tramite un connettore a Y e utilizzare un altro tratto di tubo in silicone per dirigere il flusso d'aria attraverso un matraccio di miscelazione vuoto o bottiglia con sezioni piegate pipetta di vetro inseriti attraverso un tappo di gomma a due forata. Utilizzare un altro pezzo di tubo in silicone per il flusso d'aria mista di uscita.
  3. Assemblea della Vial osservazione
    1. Dividere il flusso d'aria presa emergente dalla miscelazione pallone da 2-3x avere 4 o 8 flussi minori di aria in modo che più flaconi di osservazione possono essere usate in ogni esperimento. Collegare il tubo in silicone flessibile alle fiale di osservazione.
    2. Impostare il observatifiale utilizzando flaconi vuoti sigillati con un tappo di gomma contenente due fori attraverso i quali tubi di vetro offrono un ingresso ed una uscita per il vapore di alcool.
    3. Coprire l'estremità del primo tubo di vetro con rete e mantenere la rete in posizione con un piccolo pezzo di tubo di plastica flessibile. Inserire questo tubo attraverso il primo foro finché non si protrae a circa metà della lunghezza del flacone. Se necessario, usare nastro Teflon per ottenere una perfetta aderenza.
    4. Inserire il secondo tubo di vetro anche con l'estremità coperta da rete a filo con il bordo interno del tappo di gomma.
    5. Posizionare le fiale orizzontalmente su un pezzo di carta bianca per massimizzare il contrasto con le mosche in condizioni di luce rossa.
    6. Mix appropriato frazioni della corrente d'aria gorgogliati attraverso l'alcol e il flusso d'aria gorgogliare attraverso acqua. Monitorare la pressione d'aria continuo e apportare le modifiche necessarie per mantenere la miscelazione desiderata dei flussi d'aria.
      Nota: la corsa continuadi numerosi saggi Fly Bar in parallelo o anche un singolo test in una piccola stanza può portare ad un accumulo notevole di vapori di alcol. Per evitare il continuo rilascio di vapori di alcol che potenzialmente possono influenzare il ricercatore in una stanza chiusa, un adeguato sistema deve essere messo in atto che rimuove adeguatamente vapori di alcol generato durante l'esperimento. Per rimuovere vapori dell'alcool, collegare un pezzo 6-12 pollici di tubo sul secondo tubo di vetro che sporge da ogni flaconcino, unirli e diretto ad un sistema ad imbuto sotto vuoto. I ricercatori dovrebbero anche assicurare che la sala prove sperimentali sia adeguatamente ventilato.

2. Preparazione degli animali da esperimento

Motivazione e panoramica: la cultura adeguata e alloggiamento delle mosche ridurre la variabilità nei dati. Questo risultato è ottenuto attraverso la standardizzazione e la minimizzazione dello stress vissuto dalle mosche. Per questo motivo, nessuna anestesia (CO 2 o alternative) è usato during qualsiasi delle seguenti fasi del protocollo. Inoltre, in linea dovrebbero essere pari età attraverso esperimenti e punti di tempo per ridurre al minimo la variabilità come standard per altre analisi comportamentali, tra cui apprendimento e memoria esperimenti 17.

Luce diversa: condizioni scuri possono essere usati per sondare la funzione orologio circadiano nella risposta comportamentale di etanolo. Per determinare se esiste un ritmo diurno, esperimenti possono essere eseguiti in un ciclo LD definito per misurare le prestazioni a specifici Zeitgeber volte (ZT). ZT 0 rappresenta l'alba ed è definito come il tempo di luci sotto cicli LD, mentre ZT 12 è le luci di tempo sono spente con un ciclo LD 00:12 h. In condizioni costanti, il tempo circadiano (CT) misura il tempo per l'animale in assenza di segnali ambientali, ovvero tempo free-running, ed è legato al precedente ciclo LD trascinamento. In wild-type Drosophila, CT rispecchia la precedente ZT per il primo più giornis in condizioni costanti come il periodo circadiano free-running e ritmi sono ~ 24 ore. Per misurare la modulazione circadiano e di eliminare gli effetti di luce acuti sul comportamento, le mosche sono trascinati alla luce: i cicli di buio e poi trasferiti a costanti condizioni di buio (DD) prima di esperimenti. Circadiani esperimenti vengono eseguiti il ​​secondo giorno di DD per misurare le prestazioni a specifici circadiano volte (CT).

In Drosophila, luce continua (LL) le condizioni provocano disfunzioni circadiano con oscillazioni molecolari inumidite o aboliti del nucleo geni circadiani e rottura dei ritmi circadiani comportamentali come dimostra l'attività locomotoria aritmico 18-21 e la memoria aritmica a breve termine 17. Il protocollo è ottimizzato per studi circadiani e può essere semplificata per altri esperimenti. Tutti gli esperimenti circadiani sono condotti utilizzando la luce fioca rossa (sovraccarico ambientale luce rossa <1 lux sulla panchina alto; piccole luci rosse usato a 12 centimetri da tubi~ 1 luce lux).

  1. Posteriore in linea a 25 ° C inferiore a 12:12 h luce: condizioni di trascinamento buio (LD).
  2. Raccogliere le mosche appena eclosed al termine del periodo di luce diurna al giorno 1 e conservarli per 24 ore in condizioni di LD in possesso di flaconi contenenti una piccola quantità di cibo di alta concentrazione di agar per ridurre al minimo il cibo viscosità. Nota: Per assicurare sani, mosche normalmente sviluppate sono raccolti, utilizzare solo le mosche raccolti entro i primi giorni dopo eclosion inizia in una bottiglia cultura.
  3. Raccogliere lotti di circa 30 (25-35) vola usando un aspiratore il giorno 2 verso la fine del periodo di luce, e il trasferimento di fiale di partecipazione freschi.
  4. Utilizzare una fonte di luce forte per dirigere le mosche al fondo della fiala. All'interno di questo campo, il numero esatto di linea in ciascun flacone non è critica come osservazioni comportamentali sono riportati in percentuali con numero totale di mosche contati alla fine di ogni esperimento.
  5. Mantenere mosche in condizioni DD a 25 ° C for due giorni.
  6. Il giorno dell'esperimento, posizionare tutte le mosche alloggiati in condizioni o incubatori diversi dalla camera comportamento sperimentale nel ambiente per almeno 1 ora prima dell'esperimento differenti. Acclimatazione riduce la variabilità dovuta alle variazioni di temperatura o umidità.
  7. Fare osservazioni a sei punti temporali al giorno (CT 1, 5, 9, 13, 17 e 21) al fine di verificare la modulazione circadiano di comportamento.
  8. Confrontare più punti di tempo all'interno di una singola serie di esperimenti comportamentali per aumentare la robustezza del disegno sperimentale e minimizzare la variabilità specifica per un singolo esperimento. Ad esempio, le osservazioni di CT 1 e CT 13 possono essere ottenuti contemporaneamente se vengono utilizzati due incubatori con orari di luce-buio opposte per trascinamento.
    Nota: La procedura sopra descrive la preparazione di animali da laboratorio per le analisi eseguite in condizioni di buio costante circadiano. Luce diversa: condizioni scuri possono essere usati per sondare la funzione orologionelle risposte comportamentali all'alcool. Per determinare se un ritmo diurno esiste gli esperimenti possono essere eseguiti in un ciclo di LD per misurare le prestazioni a specifici Zeitgeber volte (ZT). Inoltre, il protocollo può essere utilizzato con le mosche sollevate in condizioni di luce costanti per i test esperimenti disfunzioni circadiano. Per i protocolli alternativi che prova in linea alloggiati in condizioni di luce, test comportamentali devono ancora essere eseguite in condizioni di oscurità. Le mosche dovrebbero essere trasferiti nel buio per 1 ora prima dell'esperimento per ridurre al minimo la variabilità del comportamento a causa degli effetti acuti della luce sul comportamento.

3. Osservazioni comportamentali

Motivazione e panoramica: il seguente protocollo amministrazione alcol è ottimizzato per le osservazioni sotto fioca condizione di luce rossa. Le due misure comportamentali Lorr e sedazione rappresentano due punti distinti di mosca ebbrezza. Lorr rappresenta un punto ritardo di ebbrezza incorporare la perdita omotore fe controllo posturale, considerando che le misure di sedazione un punto finale molto tardi di intossicazione. Genotipo o modulazione circadiano possono influire queste due misure in modo diverso; quindi si può desiderare di esaminare sia. In breve, mosche vengono caricati nelle fiale, il numero di mosche visualizzazione Lorr o sedazione è ottenuto ogni 5 minuti durante l'esposizione al vapore di alcool, e il numero totale di mosche contati alla fine dell'esperimento.

  1. Prima di iniziare l'esperimento, eseguire l'aria attraverso il sistema (aria gorgogliare attraverso le bottiglie di acqua e alcool) per almeno 10 minuti e usare questo tempo per calibrare i flussi d'aria.
  2. Scollegare il rilascio rapido per fermare il flusso d'aria. Caricare le mosche in fiale, e ricollegare il flusso d'aria e avviare il timer. Nota: se le mosche che non rispondono o mosche morte vengono lasciati in fiale di partecipazione, questo potrebbe essere indicativo di condizioni di stress. In generale, queste condizioni possono essere mitigati ospitando un numero inferiore di mosche in fiale che tengono o diminuendo il cibo vischiosità con un leggeroconcentrazione di agar ly più alto durante la preparazione dei cibi. Per le analisi comportamentali ottimali e minima variabilità tra esperimenti, in linea dovrebbero essere sani prima di esperimenti.
  3. Per il tempo esatto che mantiene, utilizzare uno timer per tenere traccia del tempo totale di esposizione alcol e utilizzare un secondo timer count-back per contrassegnare gli intervalli di 5 min.
  4. Posizionare un pezzo di carta bianca sotto le fiale per aumentare il contrasto e volare visibilità, soprattutto in condizioni di luce rossa fioca.
  5. Controllare il flusso d'aria regolarmente durante un esperimento di mantenere livelli costanti. Generalmente, una volta flussi d'aria sono stabilizzati, essi rimangono stabili per tutta la durata dell'esperimento.
  6. Contare il numero di mosche che hanno perso il loro riflesso di raddrizzamento volta ogni 5 minuti per un periodo di 1 ora. Poiché la sensibilità alcool varia tra genotipi e background genetico, può essere desiderabile eseguire valutazioni più frequenti o condurre l'esperimento per un periodo di tempo più lungo.
  7. Sollevare il slightl flaconcinoy dalla superficie, e dirigere la luce di una torcia a luci rosse verso la carta dietro il flaconcino. Tenere le torce rosse a mano ad una distanza di almeno 12 centimetri al flaconcino sperimentale per mantenere i livelli di luce non superiori a 1 lux per tutti gli esperimenti in condizioni di luce rossa.
  8. Misurare i livelli di luce con un esposimetro a stabilire norme per tutti gli esperimenti.
  9. Determinare il numero di mosche che hanno perso il loro riflesso di raddrizzamento mediante l'applicazione di un rubinetto ditta per la fiala e contare quante mosche non riescono a raddrizzare se stessi all'interno di circa 4 sec. Mosche che visualizzano Lorr può ancora muovere le gambe e le ali, ma non può trasformarsi in posizione verticale.
  10. Alla fine della sessione, contare il numero totale di linea in ciascun flacone.
    Nota: Di tanto in tanto, una mosca può essere preso tra il tappo e il lato durante il caricamento vola in fiale sperimentali. Poiché questo è fatto al buio, potrebbe non essere prontamente notato quindi è necessario contare insensibile totaleer di mosche alla fine dell'esperimento per calcolare correttamente percentuali.

Inoltre, questa procedura può anche essere usato per misurare la sedazione di mosche, che rappresenta un endpoint comportamentale differente. Mentre le mosche sedati hanno perso il loro riflesso giusto, sedazione richiede una maggiore esposizione all'alcol. Comportamentale, sedazione può essere caratterizzata dalla totale mancanza di attività apparente motore con mosche rimanendo immobili nel flaconcino seguente ditta aa toccare al flaconcino. Per la sedazione, contare il numero di mosche che restano immobili senza gamba agitando dopo la consegna di un rubinetto azienda del flacone. Inoltre, il flaconcino può essere arrotolato un lato all'altro per determinare se i singoli linea conservano ancora il loro riflesso grabbing.

4. Analisi dei dati

  1. Determinare la percentuale Lorr a ogni volta valutata in base al numero totale di linea in ciascun flacone.
  2. Differenze di stima compresa tra i punti temporali circadiani o ceppi di calculating il Lorr 50% per ciascun campione, che rientra nella porzione lineare della curva sigma (Vedi figura 2).
  3. Statistiche alternativi:
    1. Se si prevedono confronti tra genotipi, è opportuno analizzare l'intero corso di tempo con misure ripetute ANOVAand per determinare l'intervallo di punti temporali che le differenze siano significative test post-hoc (Figura 3). Per questi test, si preferisce utilizzare un valore di 0,001. Questo permette differenze a tempi di esposizione individuali da valutare, così come le differenze tra genotipi nella pendenza della curva.
    2. Differenze di sensibilità per possono essere determinati momenti specifici di esposizione dell'alcool una risposta particolare come sedazione dalla porzione lineare del grafico (Figura 4).
    3. Le differenze tra ceppi o punti di tempo circadiano possono essere stimati con F-statistiche standard e test post-hoc.

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Risultati

Modulazione circadiano di alcol sensibilità con la Lorr 50% come marcatore.

Un esempio rappresentativo che mostra modulazione circadiano in alcool sensibilità durante il giorno è presentato in Figura 2. Lorr stata misurata a sei punti di tempo durante il 2 ° giorno di DD in Canton-S e il 50% Lorr stato determinato per ciascun punto di tempo. L'analisi ha dimostrato un effetto significativo del momento della giornata (ANOVA: F 5,45 = 7.39, p...

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Discussione

I costi di abuso di alcol e l'alcolismo per la società è enorme, sia in termini di costi umani ed economici 29 30,31. Drosophila come modello offre un sistema veloce e versatile per esaminare rapidamente le risposte comportamentali di un gran numero di individui e come tale è stato ampiamente utilizzato sia per l'alcol 5,7,32-34 e ricerca circadiano 35-37.

Qui, abbiamo descritto un protocollo semplice per la somministrazione controllata di va...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

Finanziamento per questa ricerca è stato fornito da un programma in Neuroscienze Award dalla Florida State University College of Medicine e il sostegno del Dipartimento di Scienze Biologiche a FSU. Il finanziamento aggiuntivo è stato fornito da un Grant-in-Aid dal Fondo di Ricerca di alcol Beverage Produttore.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Alcool 190 provaVari
AeratoreNegozioUsiamo Whisper 60
Tubo in silicone 1/8 "VWR408060-0030
120° Connettore a YVWR82017-256
Sganciatori rapidiVWR46600-048
Morsetti per tubi in plastica ProdottiBell-art132250000O questo o il prossimo
Regolatore d'aria in miniaturaMcMaster-Carr8727K11O questo o il precedente Staffa
di montaggio del regolatore d'aria in miniaturaMcMaster-Carr9891K66
Misuratore di portata Gilmont misura 12VWR29895-242
Clip per attrezziMcMaster-Carr1722A43Per contenere i misuratori di portata
FialaVWR89092-722
Tappo in gomma con due foriVWR59585-186Si adatta a fiale
tubi di vetro Pyrex da 5 mmTrikineticsPGT5x65Si adatta meglio al tappo precedente
Nastro in teflonFerramentaPer ottenere una perfetta aderenza nei tappi, se necessario
Tappo in gomma con due foriVWR59582-122Adatto alle nostre bottiglie
Pipette di vetro usa e gettaVWR53283-768Tagliato a misura e piegato mediante riscaldamento
Rete di nylon molto fineVWRVarie
lampadine da 15 watt Negozio diferramentaLuce rossa
dall'altoFiltriLuce rossa dall'alto
Mini torce elettriche con filtri rossiMag-light
di animali locale in fotografici per luce rossa di sicurezza

Riferimenti

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