Articolo metodologico

RNAi mediato doppia Gene atterramento e gustative Percezione misura di api mellifere (

DOI:

10.3791/50446

⸱

25 luglio 2013

 ,  , 
1School of Life Sciences, Arizona State University , 2Department of Chemistry, Biotechnology, and Food Science, Norwegian University of Life Sciences

In questo articolo

Sommario

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In questo protocollo, si descrive due strategie che sopprimono contemporaneamente due geni (doppia knockdown gene) di api mellifere. Poi ci presentiamo come usare la risposta estensione proboscide (PER) test per studiare l'effetto di doppio knockdown gene sul miele d'api percezione gustativa.

Abstract

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Questo video mostra nuove tecniche di RNA interference (RNAi), che downregulate due geni contemporaneamente in api utilizzando iniezioni di RNA a doppio filamento (dsRNA). Essa presenta anche un protocollo di risposta estensione proboscide (PER) test per la misurazione della percezione gustativa.

RNAi-mediata knockdown gene è una tecnica efficace downregulating espressione del gene bersaglio. Questa tecnica è solitamente utilizzata per la singola manipolazione genica, ma ha limitazioni di rilevare interazioni ed effetti congiunti tra geni. Nella prima parte di questo video, vi presentiamo due strategie per battere contemporaneamente giù due geni (chiamati doppia knockdown gene). Mostriamo entrambe le strategie sono in grado di sopprimere efficacemente due geni, vitellogenina (vg) e ultraspiracle (USP), che sono in un ciclo di feedback normativo. Questo doppio approccio knockdown gene può essere utilizzato per analizzare interrelazioni tra geni e può essere facilmente applicato indiverse specie di insetti.

La seconda parte di questo video è una dimostrazione di proboscide estensione della risposta (PER) saggio di api mellifere, dopo il trattamento di doppia knockdown gene. Il saggio PER è un test standard per misurare la percezione gustativa di api mellifere, che è un fattore predittivo fondamentale per la velocità con la maturazione comportamentale un miele di ape è. Maggiore percezione gustativa di api nido indica maggiore sviluppo comportamentale, che è spesso associata a una precedente età di insorgenza di foraggiamento e di foraggiamento specializzazione nel polline. Inoltre, per saggio può essere applicata per identificare gli stati metabolici di sazietà o di fame di api mellifere. Infine, per saggio combinato con l'associazione diversi stimoli odore per il condizionamento delle api è anche ampiamente usato per l'apprendimento e la memoria gli studi di api mellifere.

Introduzione

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RNA interference (RNAi) è RNA a base di post-trascrizionale silenziamento genico, che si verifica in una grande varietà di organismi eucarioti. Il processo di RNAi è attivato da RNA a doppio filamento (dsRNA) precursori endogeni o esogeni. Il dsRNA attiva la proteina Dicer ribonucleasi che lega e scinde il dsRNA di piccoli frammenti (20-25 bp). Poi i piccoli frammenti della guida dsRNA un riconoscimento e di clivaggio mRNA complementari da proteine ​​argonaute, un componente catalitico di indotto da RNA silencing complex (RISC) 1. Nei mammiferi, dsRNAs più di 30 nt, attivano una risposta antivirale (risposta all'interferone, IFN), che porta alla degradazione aspecifica di RNA trascritti 2. Tuttavia, lunghi dsRNAs hanno dimostrato di essere efficaci e specifici negli insetti poiché non vi è una mancanza di questo IFN 3.

DsRNAs lunghi sono stati utilizzati per sottoregolazione di geni bersaglio in diverse specie di insetti. Le api da miele sono uno del pioneorganismi di insetti eer in cui le funzioni di molti geni importanti per lo sviluppo e il comportamento sono stati rivelati mediante dsRNA 4,5. Diversi metodi di consegna dsRNA sono stati eseguiti in api: dsRNA alimentazione downregulates efficiente espressione del gene bersaglio nel miele delle api larve 6, mentre l'iniezione dsRNA è un approccio efficace per il knockdown gene in embrioni di miele d'api 4 e api adulte 7,8.

Gene effetti knockdown esposti applicando dsRNA di insetti sono transitori e localizzati. Studi hanno dimostrato che entrambe le iniezioni dsRNA addominali e iniezioni dsRNA toraciche sopprimere efficacemente l'espressione del gene bersaglio in cellule addominale di grasso corporeo di insetti 9,10. DsRNA viene iniettato nella cavità addominale e toracica e le cellule di grasso corporeo sono in grado di riprendere il dsRNA dal emolinfa in cui le cellule sono immerse 10. Tuttavia, i geni in altri organi, come ovaie ei cervelli, non possono essere bersaglio di unoiniezioni addominali o toracici. Al fine di mirare geni nel cervello miele ape, iniezione di dsRNA cervello è stato anche eseguito, che influenza in modo efficace espressione del gene bersaglio in aree cerebrali locali 11. Qui, noi documentiamo solo dsRNA iniezione addominale che è più comunemente usato in api adulte.

RNAi è stato principalmente utilizzato per mirare ad un singolo gene ed è stato un potente strumento per rivelare la funzione del gene. Tuttavia, qualsiasi gene non è isolato dagli altri, ma è in reti complesse di regolazione. Una chiave per comprendere un processo biologico è di sezionare come i geni interagiscono tra loro, che richiede manipolazioni simultanee di geni multipli, piuttosto che un singolo gene knockdown. In linee cellulari di mammiferi, gli scienziati sono riusciti a inibire simultaneamente due o tre geni utilizzando sistemi di consegna 12 o più microRNA (miRNA) disegni tornante 13. Ma negli insetti, più atterramenti geni sono ancora collaudati. Qui, Present strategie di iniezione differenti in modo da raggiungere un duplice knockdown gene. Ci rivolgiamo due geni: vitellogenina (vg), che codifica per una proteina precursore tuorlo, e ultraspiracle (USP), che codifica per un recettore putativo di ormone giovanile (JH) e può servire come un fattore di trascrizione mediare le risposte a JH 14 di api mellifere. Vg e JH regolano a vicenda in un ciclo di feedback 15 e sono coinvolti nel miele delle api comportamentale regola 9. Usando il doppio knockdown gene, abbiamo turbare entrambi Vg e percorsi JH, e scopriamo come influenzano congiuntamente comportamento delle api il miele e la fisiologia e come vg, USP e JH interagiscono 9.

Percezione gustativa è un predittore comportamentale per il miele delle api comportamento sociale 16. In termini di sviluppo del comportamento, le api nido con alta percezione gustativa comportamentale veloci maturo, e di solito foraggio primi anni di vita e preferiscono raccogliere il polline 16,17. Sebbene m normativoechanisms sottostanti percezione gustativa sono ancora poco chiari, gli studi hanno dimostrato che la percezione gustativa è legata a metabolismi energetici interni 9, la secrezione ormonale 18,19 e biogenetica ammina percorsi 20. Sia Vg e JH sono importanti regolatori ormonali modulando la percezione gustativa 7,21. In laboratorio, una variazione di percezione gustativa in api può essere valutata analizzando la risposta estensione proboscide (PER) a soluzioni di saccarosio diversi. Ogni ape è testato toccando entrambe le antenne con una gocciolina di acqua seguita da una serie crescente concentrazione di 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% di saccarosio. Una risposta positiva si osserva se un ape estende completamente la proboscide quando una goccia d'acqua o di saccarosio è toccata a ciascuna antenna. In base al numero di risposte positive alle soluzioni, il livello di percezione gustativa di ogni individuo può essere determinato 16. Tuttavia, l'applicazione del PER non è limitato alla misura gpercezione ustatory. Il PER è anche un metodo efficace per testare lo stato metabolico delle api quali sazietà vs fame. Le api con maggiori risposte al saccarosio sono più affamato in generale (Wang e Amdam, dati non pubblicati). Inoltre, il paradigma PER può essere utilizzato anche in apprendimento associativo e la memoria di api mellifere. In questo caso le api saranno addestrati per associare la presenza dell'acqua saccarosio con un odore. Quando le api imparano l'associazione, solo la presenza di odore può evocare una risposta positiva proboscide senza premiare con il saccarosio 22,23. In questo video vi mostriamo come effettuare PER per valutare la percezione gustativa che è stato collegato con vg e USP doppio atterramento in uno studio precedente 9.

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Protocollo

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Parte 1: RNAi mediato doppio knockdown gene

1. dsRNA Synthesis

  1. Progettazione di primer dsRNAs rivolte vg, USP e un gene codificante la proteina fluorescente verde di controllo (GFP), che non è nel miele delle api genoma: primer sono stati progettati utilizzando il software gratuito online di Primer3 ( http://frodo.wi.mit.edu/ ) .
  2. sintesi di dsRNA per vg, USP e GFP: uso RiboMax T7 sistema di produzione di RNA da Promega per la trascrizione in vitro.
  3. dsRNA purificazione:
    1. Denaturazione e rinaturazione: il calore del dsRNA a 85 ° C per 5 minuti e lasciare raffreddare a temperatura ambiente per 1 ora.
    2. DNasi trattamento I: aggiungere 1 ml DNasi I in ciascuna reazione dsRNA e mescolare muovendo i tubi. Incubare per 15 minuti a 37 ° C.
    3. Aggiungere 150 microlitri di acqua priva di nucleasi e 750 microlitri TRIzol - LS in ogni reazione, e mescolare delicatamente loro da inverting il tubo. Incubare i campioni per 5 min a 30 ° C.
    4. Aggiungere 200 microlitri cloroformio in ciascun campione. Mescolare energicamente per 20 sec. Centrifugare i campioni per 15 min a 12.000 xga 4 ° C.
    5. Trasferire la fase surnatante a ciascuna nuova provetta e aggiungere 500 alcool isopropilico microlitri in ciascun tubo. Mescolare capovolgendo la provetta. Incubare la miscela per 20 minuti a -20 ° C. Centrifugare per 10 minuti a 12.000 xg a 4 ° C.
    6. Rimuovere il surnatante e utilizzare 1,000 microlitri 75% di etanolo per lavare il pellet. Dopo centrifugazione del tubo per 5 minuti a 7500 xga 4 ° C, l'aria secca dsRNA pellet, e utilizzare acqua priva di nucleasi per sciogliere il pellet. Per assicurare l'efficacia del gene down-regolazione, la concentrazione dsRNA dovrebbe essere di circa 9 -10 mg / mL.

2. dsRNA iniezione addominale

Per il doppio knockdown gene, ci sono due strategie: 1) iniezione singola: dsRNA miscela di due geni e inject miscela; 2) due giorni di iniezione: iniettare il primo dsRNA di targeting un gene il primo giorno, e iniettare il secondo dsRNA nelle stesse api il secondo giorno.

  1. Freddo di recente emerso api in un 4 ° C frigorifero per 1-2 min. Quando le api sono immobilizzati, montare 3-4 api in parallelo su piastre di Petri piene di cera solida con perni di insetti incrociate tra loro addomi e thoraces.
  2. Raffreddare ancora le api in un 4 ° C frigorifero. Assicurarsi che le api sono completamente immobile. Ci vogliono circa 1-2 min. Le api devono guardare sciolta. Se le api diventano arricciate o contorta, vuol dire che sono raffreddati troppo tempo che dovrebbe essere evitato. Raffreddando troppo causa alta mortalità, ma completa immobilizzazione è importante come qualsiasi movimento aumenta la dimensione della ferita e mortalità.
  3. Metti un usa e getta 30 ago G (BD) in un Hamilton micro siringa. Prendere 3 dsRNA microlitri e assicurarsi che non vi è alcuna bolla d'aria nella siringa. L'ago viene inserito in un lato dell'addome per evitare damaging organi interni. Premere lentamente lo stantuffo della siringa per consentire il dsRNA di essere assorbito. Poiché dsRNA è molto viscoso, richiede 2-3 secondi per essere completamente espulso dalla siringa. Dopo aver completamente spingendo verso il basso il pistone, lasciare l'ago nella ferita per 4-5 sec. Osservare le api per 3-5 sec dopo le iniezioni. Se un emolinfa gocciolina perdite dalla ferita, scartare l'ape.
  4. Utilizzare colori diversi per contrassegnare i loro thoraces corrispondenti ai diversi trattamenti. A questo punto, se è stata utilizzata la strategia di iniezione singola, le api possono essere messi di nuovo in una colonia dopo 1 ora di osservazione. Tuttavia, se è stata utilizzata la strategia di iniezione di due giorni, dopo l'iniezione con il primo dsRNA, le api devono essere posti in una gabbia di rete cilindro con miele fornito sul lato ed essere mantenute in un incubatore a 34 ° C e 80% di umidità .
  5. Il secondo giorno, seguire i punti 2.2 e 2.3 per rilassarsi le api nelle gabbie in rete e montarli su lastre di cera. Eseguire iniezioni con il secondo dsRNA come è descriletto nel passo 2.4.
  6. Lasciate che le api recuperano a temperatura ambiente per 1 ora e li introducono in una colonia.

Nota: Gli effetti Knockdown possono essere rilevate da RT-PCR quantitativa (RT-PCR quantitativa) e western blotting. In generale, l'efficacia knockdown varia e dipende da molti fattori. Nel nostro studio, il doppio knockdown gene può essere rilevato 7 giorni dopo singole iniezioni e le iniezioni di due giorni.

Parte 2: proboscide estensione di risposta (PER) assay

1. Raccolta api dall'alveare

Il giorno 6 dopo le iniezioni, raccogliere le api trattate dalla colonia senza utilizzare un fumatore. Raccogliere api in metallo gabbie cilindro mesh. Mantenere tre api in ogni gabbia.

2. Api di montaggio per PER

Raffreddare le api a 4 ° C fino a completa immobilizzati. Montare ogni ape verticalmente in un tubo di plastica appositamente progettato per PER. Mantenere l'addome all'interno del tubo da using due piccoli pezzi di nastro, e mantenere la testa fuori dal tubo. Mettere le provette su un rack a due ordini di colonnine di plastica, e assegnare ogni tubo (ape), con un numero ID. Poi mettere le api trattate sugli scaffali in un incubatore (34 ° C e 80% di umidità) e tenerli in incubatrice per 2 ore.

3. Preparazione di una serie di saccarosio Water Solutions

Preparare 0%, 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% e soluzioni acquose di saccarosio 30% e caricare le soluzioni in siringhe con ago G 15-20.

4. Per saggio

Toccare l'antenna del ape con una goccia di soluzione di 0% (acqua) seguito da 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% e soluzioni acquose di saccarosio 30%. Provare tutte le api con acqua prima e consentono almeno due minuti come l'intervallo tra ogni soluzione viene utilizzato. Pertanto, di solito abbiamo almeno 20 api per ogni prova. Se un'ape si estende completamente la proboscide, una risposta positiva viene contato.

5.Gestione dei dati

Sommare il totale delle risposte positive per ogni individuo per il punteggio risposta gustativa (GRS). Effettuare un'analisi statistica appropriata sui dati.

Parte 3. Convalida knockdown gene

Corpi grassi sono sezionati da un altro set di 7 giorni di età api trattate. Una procedura TRIzol standard è utilizzato per l'estrazione di RNA, che è seguita da un trattamento DNasi I 24. Vg e l'espressione genica USP è analizzato da un due fasi qRT-PCR. Actina è usato come un gene di riferimento in quanto ha espressioni stabili in differenti tessuti delle api. Pubblicato primer PCR real-time per vg e USP gene sono utilizzati in questo esperimento 24. I dati sono analizzati utilizzando Delta-Delta metodo CT 25.

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Risultati

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Sia l'iniezione singola e due giorni a iniezione strategie ridotto significativamente vg (One-way ANOVA, p <0.001) (Figura 2A) e USP (One-way ANOVA, p <0.001) (Figura 2B) livelli di trascrizione di api sei giorni dopo il dsRNA è stato iniettato. La soppressione della trascrizione USP utilizzando la singola iniezione con miscela dsRNA e l'iniezione di due giorni con vg primo e secondo USP (vg / USP) era significativament...

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Discussione

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Il nostro studio è il primo tentativo di battere contemporaneamente giù due geni in insetti adulti. I nostri risultati mostrano che le due strategie di dsRNA iniezioni (singola iniezione e iniezione di due giorni) sono efficaci per il doppio repressione genica, e simultanea silenziamento genico di vg e USP possono essere testati 6 giorni dopo le iniezioni dsRNA in api 8,9. Tuttavia, l'efficacia gene knockdown varia nelle diverse specie di insetti seconda del livello di trascrizione del g...

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Dichiarazioni

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare Erin Fennern per assistere esperimento. Questo lavoro è stato finanziato dal Consiglio di ricerca della Norvegia (180504, 185306 e 191699), PEW Charitable Trust, e il National Institute on Aging (NIA P01 AG22500).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Perle PCR GE Healthcare in piastra a 96 pozzettiGE Healthcare27-9557-01
Kit di purificazione PCR QIAquickQiagen28104
RiboMax T7 Sistema di produzione di RNAPromegaP1300
Trizol LSInvitrogen10296028
Cloroformio: Alcool isoamilico 24:1Sigma-AldrichC0549
alcool isopropilicoSigma-AldrichI9516
micro siringa HamiltonHamilton80301
30G BD aghi monousoBD Biosciences305106
SaccarosioSigma-Aldrich84097
1 ml siringaBD Biosciences30960
Microscopio a dissezione stereoLeica MicrosystemsS6D
Spille per insettiFine Science Tools26000-25
Piastra in cera

Riferimenti

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Iniezione di RNA a doppio filamentoSaggio della risposta di estensione della proboscideKnockdown del gene della vitellogeninaKnockdown del gene UltraspiracleRegolazione genica nell ape melliferaAnalisi tramite PCR in tempo realeTest con soluzione di saccarosioRegolazione dell ormone giovanile

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