Articolo metodologico
Il lievito mitocondriale proteina nucleoide, Mgm101, è una proteina di ricombinazione RAD52-tipo che forma grandi anelli oligomeriche. Un protocollo è descritto da preparare Mgm101 solubile ricombinante utilizzando la proteina legante il maltosio (MBP)-tagging strategia accoppiato con scambio cationico e cromatografia ad esclusione dimensionale.
Il gene è stato identificato MGM101 20 anni fa per il suo ruolo nel mantenimento del DNA mitocondriale. Studi condotti in diversi gruppi hanno suggerito che la proteina Mgm101 è coinvolta nella riparazione ricombinazione del DNA mitocondriale. Recenti indagini hanno indicato che Mgm101 è legato alla famiglia RAD52-tipo ricombinazione proteica. Queste proteine formano grandi anelli oligomeriche e promuovere la ricottura di molecole di DNA a singolo filamento omologo. Tuttavia, la caratterizzazione di Mgm101 è stata ostacolata dalla difficoltà di produrre la proteina ricombinante. Qui, una procedura affidabile per la preparazione di Mgm101 ricombinante è descritto. Il maltosio Binding Protein (MBP)-tag Mgm101 è prima espressa in Escherichia coli. La proteina di fusione è inizialmente purificato mediante cromatografia di affinità amilosio. Dopo essere stato rilasciato da clivaggio proteolitico, Mgm101 è separato da MBP mediante cromatografia di scambio cationico. Monodisperso Mgm101 è quindi ottenutoper cromatografia ad esclusione dimensionale. Una resa di ~ 0,87 mg di Mgm101 per litro di coltura batterica può essere ottenuta routine. Il Mgm101 ricombinante ha la contaminazione minima di DNA. I campioni preparati sono utilizzati con successo per biochimici, strutturali e singola particella analisi dell'immagine di Mgm101. Questo protocollo può essere utilizzato anche per la preparazione di altri grandi oligomeriche proteine che legano il DNA che possono essere mal ripiegate e tossici per le cellule batteriche.
Ricombinazione omologa è importante per la riparazione delle rotture del doppio filamento (DSB) e interstrand legami crociati, e per la ripresa della replicazione del DNA da forche di replicazione crollate 1. Nel convenzionale ricombinazione omologa, la reazione è catalizzata centrale dalle ricombinasi ATP-dipendenti comprese RecA nei procarioti e Rad51 e Dmc1 negli eucarioti 1-3. Questi ricombinasi formano filamenti nucleoproteici sul ssDNA, che sono essenziali per l'avvio ricerca di omologia e invasione filone all'interno dei modelli di DNA duplex (Figura 1, pannello di sinistra) 4-7. Oltre alla schema conve....
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Precedenti studi hanno dimostrato che i primi amino-terminali 22 residui di Mgm101 sono spaccati dopo l'importazione in mitocondri 19. Per l'espressione in Escherichia coli, la cornice di lettura aperta MGM101 mancano i primi 22 codoni viene amplificato mediante PCR e collocato a valle della sequenza codificante la proteina MASCHIO legante il maltosio (MBP) in una versione modificata del vettore di espressione pMAL-c2e. Questo genera la fusione MBP-Mgm101 con un linker che contiene un sito di taglio per la proteasi prescissione (Figura 3). Il plasmide viene costruito selezionando E. trasformanti ....
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Mgm101 è una proteina di ricombinazione RAD52-correlati nei mitocondri. RAD52 è stato ampiamente studiato per il suo ruolo nella ricombinazione del DNA mitocondriale (Figura 1). Ricombinante Mgm101 può essere preparato da una procedura in tre fasi (Figura 2). Ciò è facilitato dall'utilizzo della strategia MBP-tagging che permette Mgm101 essere espressi in una forma solubile e successivamente rilasciato dal tag da taglio proteolitico (Figura 3).
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E 'stata una sfida per la produzione di una stalla, nativo Mgm101 proteina ricombinante da E. coli forse a causa della sua insolubilità in cellule batteriche. In questo rapporto, si dimostra che la strategia di MBP-fusione permette la proteina da esprimere ad un livello ragionevolmente elevato. Mediante microscopia elettronica a colorazione negativa e cromatografia ad esclusione dimensionale, abbiamo precedentemente dimostrato che la proteina di fusione MBP-forma oligomeri uniformi in vitro 18.......
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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamo Stephan Wilkens aiuto in microscopia elettronica a trasmissione. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health di Grant R01AG023731.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vettore di espressione pMAL-c2E | New England Biolabs | #N8066S | |
| Prescission Proteasi | GE Healthcare Life Sciences | #27-0843-01 | |
| BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells | Strategene | #230245 | |
| Leupeptin | Roche Applied Science | #11034626001 | |
| Pepstatin | Roche Applied Science | #11359053001 | |
| Fluoruro di fenilmetilsulfonile (PMSF) | Roche Applied Science | #10837091001 | |
| DNAsi I | Sigma | #DN25-1G | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Roche Applied Science | #11411446001 | |
| Resina di amilosio | New England Biolabs | #E8021L | |
| Colonna | per cromatografia Econo-ColumnBIO-RAD | #7372512 | |
| Cartuccia Bio-Scale Mini Macro-Prep High S (1 ml) | BIO-RAD | #732-4130 | |
| VIVASPIN 15R Colonna rotante per ultrafiltrazione (10.000 MWCO) | Sartorius Stedium | #VS15RH02 | |
| Colonna Superose 6 per la preparazione | Amersham Bioscirnces | #17-0489-01 | |
| VIVASPIN 6 Colonna rotante per ultrafiltrazione (5.000 MWCO) | Sartorius Stedium |
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