Proteine ​​saggezza: un banco di lavoro per<em&gt; In silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Progettazione di biomolecole

Sommario

Abbiamo sviluppato metodi computazionali di progettazione di proteine de novo in grado di affrontare diverse importanti aree della progettazione di proteine. Per diffondere questi metodi presentiamo Protein WISDOM, uno strumento online per la progettazione di proteine (http://www.proteinwisdom.org). Partendo da un modello strutturale, è possibile eseguire la progettazione di proteine monomeriche per una maggiore stabilità e di complessi per una maggiore affinità di legame.

Abstract

L'obiettivo di disegno de novo di proteine ​​è di trovare le sequenze amminoacidiche che si piega in una struttura 3-dimensionale desiderata con miglioramenti nelle proprietà specifiche, quali affinità di legame, agonista o antagonista comportamento, o stabilità, relativi alla sequenza nativa. Progettazione di proteine ​​si trova al centro del progresso attuale progettazione di farmaci e di scoperta. Non solo progettazione di proteine ​​fornisce previsioni per bersagli farmacologici potenzialmente utili, ma migliora anche la nostra comprensione del processo di folding delle proteine ​​e le interazioni proteina-proteina. Metodi sperimentali come evoluzione diretta hanno dato risultati positivi in ​​progettazione di proteine. Tuttavia, tali metodi sono limitate dallo spazio sequenza limitata che possono essere cercati trattabile. In contrasto, strategie di progettazione computazionali permettono la proiezione di un insieme più ampio di sequenze che coprono una vasta gamma di proprietà e funzionalità. Abbiamo sviluppato una serie di calcolo de novo di proteine ​​disegno metoDS in grado di affrontare diverse importanti aree di progettazione di proteine. Questi includono la progettazione di proteine ​​monomeriche per una maggiore stabilità e complessi per una maggiore affinità di legame.

Per diffondere questi metodi per il più ampio uso presentiamo SAGGEZZA Proteine ​​( http://www.proteinwisdom.org ), uno strumento che fornisce metodi automatici per una varietà di problemi di progettazione di proteine. Modelli strutturali sono state inoltrate per inizializzare il processo di progettazione. La prima fase di progettazione è una sequenza fase di selezione di ottimizzazione che mira a migliorare la stabilità mediante minimizzazione dell'energia potenziale nello spazio sequenza. Sequenze selezionate sono poi eseguiti attraverso una fase di specificità piega e una fase di affinità di legame. Una lista ordinata rango delle sequenze per ogni fase del processo, insieme con strutture progettate pertinenti, fornisce all'utente una valutazione quantitativa completa del disegno. Qui forniamo i dettagli of ciascun metodo di progettazione, così come diversi successi notevoli sperimentali ottenuti attraverso l'uso dei metodi.

Introduzione

Il design delle proteine de novo è l'identificazione di sequenze proteiche che produrranno una struttura terziaria desiderata con proprietà o funzioni migliorate. Poiché il ripiegamento nativo di una proteina è la conformazione che si trova al minimo di energia libera, la progettazione di proteine de novo cerca sequenze che avranno un minimo di energia libera nel ripiegamento bersaglio. Questo problema è stato descritto per la prima volta da Drexler¹ e Pabo² ed è stato definito "problema di ripiegamento inverso". Tuttavia, a differenza del problema del ripiegamento delle proteine, in cui una sequenza può produrre una sola soluzione di struttura ripiegata, il problema de novo della progettazione delle proteine mostra degenerazione. Molte diverse sequenze di amminoacidi possono produrre la stessa struttura e funzione terziaria.

Mentre la progettazione delle proteine è stata tradizionalmente eseguita sperimentalmente attraverso la progettazione razionale e l'evoluzione diretta, i metodi computazionali sono stati impiegati più recentemente per superare lo spazio di ricerca limitato inerente ai metodi sperimentali. Sono stati utilizzati una varietà di metodi computazionali, inclusi metodi deterministici, metodi stocastici e metodi probabilistici. ^3,4 I primi metodi computazionali utilizzavano modelli a spina dorsale fissa per rendere il problema più facile da risolvere. ^5-7 Con l'avvento di processori più veloci, calcolo ad alte prestazioni e algoritmi più efficienti, la flessibilità della dorsale è stata incorporata utilizzando un insieme di modelli a spina dorsale fissa^8-14 o incorporando la vera flessibilità della dorsale esprimendo il modello in termini di intervalli di distanze da atomo ad atomo e angoli diedri. ^15,16

Questo articolo descrive in dettaglio Protein WISDOM, uno strumento online che è stato messo a disposizione della comunità accademica per utilizzare il nostro framework computazionale di progettazione di proteine de novo. Questo quadro è stato applicato alla progettazione di numerose proteine, per uso terapeutico mirate a malattie come l'HIV, il cancro, le malattie del complemento e altre malattie autoimmuni. Molti dei peptidi previsti sono stati convalidati sperimentalmente, dimostrando la potenza del metodo. La tabella 1 fornisce un riepilogo delle diverse proteine che sono state progettate, comprese le dimensioni della proteina o del peptide, il numero di previsioni e la convalida sperimentale.

Progettazione delle proteine Lunghezza delle proteine # di previsioni computazionali # di Convalide Sperimentali riferimento Progettazione dell'intera sequenza della beta-defensina-2 umana 41 340   (17) Inibitori della compstatina del C3 umano 13 28 3/3 (18, 19) Analoghi della compstatina che si legano al C3c di ratto 13 5   E 20 Analoghi della Compstatin con estensione della di-serina 15 8     Struttura stabilizzante dell'analogo della compstatina W4A9 13 18     Agonisti e antagonisti del recettore C3a 77 20 4/7 E 21 Agonisti e antagonisti del recettore C5a 74 61 2/61   Inibitori dell'HIV-1 gp14 12 6 4/5 (22) Inibitori dell'HIV-1 gp120 9 14     Inibitori Bak di Bcl-x L e Bcl-2 16-18 anni 10 5/5 (23) Inibitori di ERK2 11 25     Inibitori di EZH2 21 17 10/10 (24) Inibitori di LSD1 e LSD2 16 41 17/20   Inibitori di HLA-DR1 13 6   (25) Inibitori della PNP 5 13    

Tabella 1. Riassunto delle proteine e dei peptidi progettati utilizzando il framework di progettazione delle proteine de novo. Il # delle previsioni computazionali è presentato come il numero di previsioni favorevoli (cioè specificità di piegatura superiori a un certo cutoff o affinità di legame approssimate maggiori della sequenza nativa). Il # delle convalide sperimentali dà due numeri: il primo è il numero di previsioni che sono state convalidate sperimentalmente, mentre il secondo è il numero totale di previsioni che sono state testate sperimentalmente.

La progettazione della beta-defensina-2 umana (hβD-2) è stata eseguita per migliorare la proprietà antimicrobica del peptide. ¹⁷ Per questo disegno, abbiamo considerato due casi: 1) fino a 10 mutazioni lungo hβD-2 e 2) disegno a sequenza completa di tutte le posizioni dei residui di hβD-2 tranne le cisteine (8, 15, 20, 30, 37 e 38). Nella progettazione sono stati utilizzati tre diversi modelli di design e tre diversi modelli di selezione delle sequenze. Alti livelli di somiglianza nelle mutazioni sono stati osservati tra la media ponderata e i modelli di distance bin sia per il disegno a 10 mutazioni che per il disegno a sequenza completa. Inoltre, è stato riscontrato che un gran numero di sequenze ha valori di specificità di piegatura calcolati più favorevoli rispetto alla sequenza nativa.

Gli inibitori del sistema del complemento (di C3, C3a e C5a) sono stati progettati per combattere una serie di malattie immunitarie come ictus, infarto, morbo di Alzheimer, asma, artrite reumatoide, rigetto di xenotrapianto, malattie respiratorie adulte, psoriasi e morbo di Crohn. Tre inibitori della compstatina di C3c previsti dal framework di progettazione della proteina più tre sequenze progettate razionalmente sono stati convalidati sperimentalmente per essere leganti migliori rispetto alla compstatina nativa. ^18,19

Ulteriori studi hanno esaminato la perdita di attività della compstatina contro il C3c non primate e hanno progettato una serie di inibitori C3c candidati per ratti e topi. Cinque sequenze hanno dimostrato di avere energie libere di associazione più favorevoli con il C3c di ratto rispetto al mutante della compstatina W4A9 noto per inibire il C3c. Ciò è dovuto a una nuova formazione di ponti salini da parte di Arg1. ²⁰ Otto sequenze con un'estensione N-terminale sono state previste come leganti migliori di W4A9 con un'estensione di-Serine. Infine, è stato previsto che 18 sequenze di compstatina stabilizzino la conformazione legata di W4A9, fornendo forti candidati per inibitori di C3c primati e non primati.

Oltre agli inibitori C3c, sono stati progettati agonisti e antagonisti dei recettori C3a e C5a basati sulle strutture di C3a e C5a. Sette sequenze C3a previste dal modello sono state testate sperimentalmente. Due delle sequenze erano potenti agonisti, mentre altre due erano agonisti parziali. ²¹ I due potenti agonisti hanno mostrato un miglioramento di 58 volte rispetto a un "superagonista" precedentemente scoperto. La progettazione di agonisti e antagonisti del recettore C5a ha fornito un set di 61 sequenze. Tutte le sequenze sono state sintetizzate e due sono risultate essere nuovi agonisti del C5a.

Gli inibitori di fusione dell'HIV-1, il virus che causa l'AIDS, sono stati progettati per impedire all'HIV-1 di infettare le cellule. Il primo progetto ha preso di mira gp41, una glicoproteina dell'involucro dell'HIV-1. Il framework di progettazione delle proteine ha previsto sei sequenze che erano leganti migliori rispetto alla sequenza nativa. Quattro di queste sequenze previste sono state convalidate sperimentalmente per inibire l'HIV-1 con la migliore sequenza con un IC₅₀ a partire da 29 μM. Questa sequenza ha mostrato un miglioramento di 3-15 volte rispetto alla sequenza nativa e non ha avuto alcuna perdita di attività contro un ceppo virale resistente all'Enfuvirtide. ²² Il secondo disegno ha preso di mira gp120, un'altra glicoproteina dell'involucro dell'HIV-1. Quattordici sequenze sono state previste come leganti di gp120 e forniscono ulteriori potenziali inibitori di fusione dell'HIV-1.

Numerose proteine legate al cancro hanno fornito bersagli promettenti per le terapie antitumorali. Bcl-2 e Bcl-x_L sono proteine anti-apoptotiche che prevengono la morte cellulare. Gli inibitori di queste due proteine sono stati progettati per indurre la morte cellulare nelle cellule tumorali. Dieci sequenze sono state previste come leganti migliori rispetto a quelle native e questi risultati hanno catturato i precedenti risultati sperimentali e di mutagenesi. ²³ Un'altra proteina bersaglio, ERK2, è coinvolta nelle cascate di trasduzione del segnale che la rendono un bersaglio promettente per le terapie antiproliferative contro il cancro. Venticinque sequenze sono state previste come inibitori di ERK2.

Le metiltransferasi e le demetilasi istoniche controllano dinamicamente la metilazione degli istoni, che è stata collegata a molti tipi di cancro tra cui prostata, mammella, linfoma, mieloma, vescica, colon, pelle, fegato, endometrio, polmone e gastrico. Il framework di progettazione proteica de novo ha identificato 17 inibitori di EZH2 (una lisina metiltransferasi) e dei dieci testati sperimentalmente, tutti sono risultati inibire EZH2. ²⁴ Il peptide più potente aveva un IC₅₀ di circa 13 μM, era ugualmente efficace con elevate concentrazioni enzimatiche e non competeva con il cofattore. Questi peptidi sono stati il primo set di inibitori di EZH2. 53 inibitori di LSD1 (una demetilasi) sono stati previsti dal quadro e dei 20 testati sperimentalmente, 17 erano inibitori di LSD1 e 18 erano inibitori di LSD2. I migliori inibitori avevano valori di IC₅₀ inferiori a 1 μM, il che li rendeva gli inibitori peptidici più potenti scoperti fino ad oggi.

Gli ultimi due sistemi proteici hanno fornito bersagli per il trattamento di varie malattie autoimmuni come la celiachia, il diabete mellito di tipo 1, il lupus eritematoso sistemico, la sindrome di Sjögren, la sindrome di Churg-Strauss, la tiroidite di Hashimoto, il morbo di Graves, la porpora trombocitopenica idiopatica, l'artrite reumatoide e le allergie. Nessuno di questi potenziali inibitori è stato convalidato sperimentalmente, tuttavia il framework ha previsto sei sequenze che si legano a HLA-DR1 e 13 sequenze che si legano a PNP.

La Tabella 2 riassume gli inibitori e gli agonisti convalidati sperimentalmente previsti utilizzando il framework di progettazione delle proteine de novo. La metrica dell'affinità di legame approssimata è stata utilizzata per prevedere nove delle sequenze (inibitori di C3c umano, HIV-1 gp41, EZH2, LSD1 e LSD2), mentre la metrica della specificità del ripiegamento è stata utilizzata per identificare quattro delle sequenze (agonisti/antagonisti di C3aR). Questi peptidi evidenziano il successo del framework di progettazione proteica de novo, in particolare la metrica di affinità di legame approssimativa aggiunta. Il framework è estremamente versatile nella sua applicabilità. Sei diverse proteine legate a venticinque diverse malattie sono state progettate con successo e convalidate sperimentalmente.

nome IC50 EC50 Bersaglio proteico Malattie applicabili SQ027 0,94 μM   umano C3c ictus, infarto, morbo di Alzheimer, asma, artrite reumatoide, lupus eritematoso sistemico, sclerosi multipla, psoriasi, diabete di tipo I, morbo di Crohn, pancreatite e fibrosi cistica SQ086 1,98 μM   umano C3c SQ059 4,73 μM   umano C3c SQ110-4   15,2 nM C3aR SQ060-4   36,4 nM C3aR SQ007-5 15,4 nM   C3aR SQ002-5 26,1 nM   C3aR SQ435 29 - 253 μM   HIV-1 gp41 AIDS SQ037 13,57 μM   EZH2 Cancro alla prostata, al seno, al linfoma, al mieloma, alla vescica, al colon, alla pelle, al fegato, all'endometrio, ai polmoni e allo stomaco SQ011-1 0,521 μM   LSD1 SQ016-1 0,249 μM   LSD1 SQ026-1 2,51 μM   LSD2 SQ015-1 1.332 μM   LSD2

Tabella 2. Peptidi predetti computazionalmente e convalidati sperimentalmente mirati a varie malattie.

Protocollo

Panoramica del metodo

Il framework di progettazione de novo utilizzato in Protein WISDOM comprende due fasi. La prima fase produce un elenco ordinato di sequenze di aminoacidi che si ripiegheranno in una determinata struttura modello. La seconda fase convalida queste sequenze calcolando la specificità di ripiegamento o l'affinità di legame approssimativa, oppure entrambe. La prima viene utilizzata principalmente quando la progettazione riguarda una singola proteina, mentre la seconda viene impiegata quando la progettazione riguarda un complesso (un peptide che si lega a una proteina bersaglio). Figura 1 fornisce una panoramica dei passaggi coinvolti nel framework.

Input di Progettazione: Per il framework di progettazione de novo di proteine, è necessario definire diversi input. Il primo è il modello di progettazione. Si tratta di una struttura proteica tridimensionale (3D) che contiene le coordinate di tutti gli atomi della proteina. La struttura può essere rigida o flessibile. I modelli rigidi consistono in un insieme di coordinate atomiche fisse, ottenute da strutture determinate mediante cristallografia a raggi X. I modelli flessibili possono comprendere un insieme di coordinate atomiche fisse oppure limiti superiori e inferiori per tali coordinate. Questi modelli possono essere ottenuti da strutture in soluzione determinate mediante NMR, dinamica molecolare o simulazioni di docking.

Il modello di progettazione viene utilizzato per generare l'insieme di mutazioni consentite della proteina progettata. Questo insieme definisce quali posizioni della sequenza possono subire mutazioni e in quali amminoacidi. L'insieme di mutazioni viene generato calcolando l'area della superficie accessibile al solvente (SASA) di ciascun residuo nel modello di progettazione. Se il residuo è esposto al solvente per più del 50%, sono consentiti un insieme di amminoacidi idrofili (D, E, G, H, K, N, P, Q, R, S, T). Se il residuo è esposto al solvente per meno del 20%, sono consentiti un insieme di amminoacidi idrofobici (A, F, I, L, M, V, W, Y). Se l'esposizione del residuo è compresa tra il 20% e il 50%, sono consentiti tutti gli amminoacidi. La cisteina è generalmente esclusa dall'insieme di mutazioni, a meno che dati sperimentali o letteratura non ne giustifichino l'inclusione. Gli amminoacidi piccoli (A, G, T) sono generalmente inclusi in tutti gli insiemi di mutazioni. Quando disponibili, informazioni sperimentali o della letteratura possono essere utilizzate per modificare manualmente gli insiemi di mutazioni di specifiche posizioni amminoacidiche.

Si sceglie un campo di forze per calcolare l'energia di interazione a coppie delle sequenze nel modello di progettazione. Sebbene qualsiasi campo di forze possa essere adattato per essere utilizzato all'interno del framework, sono stati sviluppati due campi di forze dipendenti dalla distanza, ampiamente impiegati nel framework di progettazione de novo. Il primo è un campo di forze ad alta risoluzione C^α-C^α26, in cui le distanze sono misurate tra i carboni C^α dei residui. Il secondo è un campo di forze ad alta risoluzione tra i centroidi dei residui²⁷, in cui le distanze sono calcolate tra i centroidi stessi. I parametri energetici nei campi di forze sono stati ottenuti risolvendo un problema di stima dei parametri mediante programmazione lineare, che richiedeva che i decoy ad alta risoluzione e bassa energia per un ampio insieme di proteine di addestramento fossero energeticamente meno favorevoli rispetto alle loro conformazioni native. Il campo di forze tra centroidi ad alta risoluzione e il campo di forze C^α-C^α sono stati entrambi testati e validati in studi precedenti sulla beta-defensina-2 umana¹⁷. La vera flessibilità del backbone è incorporata nel modello discretizzando i campi di forze in intervalli di distanza. La distanza tra una coppia di amminoacidi corrisponderà a un intervallo di distanza, assegnando lo stesso valore energetico a un intervallo di distanze. Ciò consente al modello di ottimizzazione della selezione della sequenza di tenere conto del movimento del backbone.

I vincoli biologici, sotto forma di vincoli di carica o vincoli di composizione, possono essere inclusi manualmente dall'utente come ulteriore parametro di progettazione. I vincoli di carica specificano una carica particolare o un intervallo di cariche che devono essere soddisfatti per la sequenza progettata o per una parte di essa. La carica viene calcolata come somma dei residui carichi positivamente (K e R) meno la somma dei residui carichi negativamente (D ed E). I vincoli di composizione specificano dei limiti superiori e inferiori per la frequenza di un particolare amminoacido nella sequenza. I vincoli biologici vengono generalmente definiti mediante un allineamento sequenziale estensivo rispetto alla sequenza nativa, al fine di rispettare i limiti biologici noti relativi alla carica e alla composizione in amminoacidi osservati in natura per una famiglia di proteine. Ulteriori vincoli vengono definiti manualmente attraverso l'analisi di dati sperimentali noti.

Fase Uno: Selezione della Sequenza: Il metodo originale di selezione della sequenza è stato sviluppato inizialmente da Klepeis et al.^15,16 Esso seleziona e ordina le sequenze di aminoacidi in base alle loro energie all'interno del modello progettuale, utilizzando un modello di ottimizzazione lineare intera (ILP). Il metodo è stato successivamente migliorato grazie all'adozione di un modello di selezione delle sequenze più efficiente dal punto di vista computazionale per modelli rigidi (singoli) ed è stato ampliato attraverso lo sviluppo di modelli per modelli flessibili. Questo metodo di ottimizzazione globale non si basa su mutazioni casuali ed è teoricamente in grado di esplorare completamente lo spazio delle sequenze determinando una soluzione globale. Questo rappresenta un vantaggio significativo del nostro approccio rispetto a tutti gli altri metodi esistenti.

Modello a Struttura Singola: La forma originale del modello di selezione della sequenza proposto da Klepeis et al.^15,16 è stata ulteriormente perfezionata da Fung et al.²⁸. La sua forma finale è riportata nell'Equazione 1.

L'insieme i=1,...,n definisce le posizioni dei residui nel modello di progettazione. In ciascuna posizione i, le mutazioni sono rappresentate da j{i}=1,...,m_i, dove m_i=20 se alla posizione i è consentito mutare in uno qualsiasi dei venti amminoacidi naturali. Gli insiemi di alias k≡i e l≡j, con k>i, vengono utilizzati per rappresentare tutte le interazioni a coppie uniche. Vengono introdotte le variabili binarie e per modellare le mutazioni degli amminoacidi. La variabile assumerà valore uno se il modello assegna l'amminoacido j alla posizione i, e valore zero altrimenti (analogamente per ). La funzione obiettivo rappresenta la somma di tutte le interazioni energetiche a coppie nel modello di progettazione. Il parametro , che è l'interazione energetica tra la posizione i occupata dall'amminoacido j e la posizione i occupata dall'amminoacido l, dipende dalla distanza tra i carboni α o i baricentri delle catene laterali nelle due posizioni (x_i,x_j,) nonché dal tipo di amminoacidi j e l. Contribuisce alla funzione obiettivo soltanto se entrambe le variabili e sono uguali a uno.

Fung et al.²⁸ hanno scoperto che la formulazione (1) è significativamente più efficiente dal punto di vista computazionale rispetto a dodici altri modelli equivalenti di tipo quadratic assignment per la selezione di sequenze.^28,29 In particolare, ha superato il modello originale proposto da Klepeis et al.^15,16 in due problemi di selezione di sequenze per la beta-defensina-2 umana: uno a un livello di complessità di 3,4×10⁴⁵ e l'altro a 6,4×10³⁷, con 49 vincoli biologici lineari aggiuntivi. Si è riscontrato che il modello originale proposto da Klepeis et al.^15,16 richiedeva rispettivamente 53.263 secondi di CPU (central processing unit) e 4.578 secondi di CPU per risolvere i due problemi fino all'ottimalità globale utilizzando CPLEX 9.0³⁰ su un processore Pentium IV da 3,2 GHz. La formulazione (1) ha richiesto soltanto 649 secondi di CPU e 14 secondi di CPU per eseguire gli stessi compiti, corrispondenti a un miglioramento dell'efficienza computazionale rispettivamente di 82 e 327 volte.

Modello della Media Ponderata: Fung et al.²⁸ hanno sviluppato due modelli per gestire il caso tipico della progettazione de novo di proteine, in cui il modello di progettazione è flessibile e comprende un insieme di strutture. Il Modello della Media Ponderata utilizza un'energia media ponderata, , al posto del parametro energetico (x_i,x_k) nel Modello a Struttura Singola (Eq. 1). I pesi wt(x_i,x_k,d) sono determinati dalle frequenze con cui la distanza tra x_i e x_k rientra nel bin di distanza d nelle strutture modello. La forma finale del Modello della Media Ponderata è riportata nell'Eq. 2.

Modello a Bin di Distanza: Il secondo modello di selezione di sequenze per strutture flessibili incorpora le informazioni di distanza provenienti da più strutture introducendo una variabile binaria b_ikd. Tale variabile assume valore uno se la distanza tra x_i e x_k rientra nel bin di distanza d, ed è zero altrimenti. Un ulteriore parametro introdotto, disbin(x_i, x_k, d), assume valore uno se la distanza tra x_i e x_k in una qualsiasi delle strutture template rientra nel bin di distanza d, ed è zero altrimenti. Poiché solo un bin di distanza per ogni coppia di amminoacidi contribuirà all'energia totale, nella funzione obiettivo viene sostituito con . Tuttavia, ciò introduce non linearità nella funzione obiettivo. Ulteriori dettagli sulla linearizzazione del modello e sui vincoli aggiuntivi necessari per la fattibilità sono disponibili in Fung et al.²⁸ Il modello a Bin di Distanza è riportato nell'Eq. 3.

Ciascuno dei problemi di Programmazione Lineare Intera (ILP) sopra formulati^15-17 può essere risolto rigorosamente mediante tecniche di branch-and-bound.^28-30 Tali tecniche garantiscono una convergenza consistente e affidabile alla sequenza di energia minima globale.

Fase Due: Convalida: Figura 2 fornisce una panoramica dettagliata dei due approcci della Fase Due. La figura mostra i passaggi necessari per calcolare la metrica finale di classificazione e il numero di strutture generate in ciascun passaggio.

Specificità di ripiegamento: La specificità di ripiegamento è una metrica utilizzata per classificare i progetti preliminari ottenuti nella Fase Uno. L'obiettivo del calcolo è determinare quanto bene ciascuna sequenza si ripiega nella struttura modello rispetto alla sequenza originale del modello, sulla base di calcoli energetici. Esistono due approcci per effettuare questa analisi, ciascuno con diverse esigenze computazionali.

Il primo approccio è stato implementato da Klepeis et al.^15,16 Questo approccio utilizza il framework di previsione della struttura proteica ASTRO-FOLD, ^26,27,31-47 basato su un'ottimizzazione globale deterministica. Attualmente, questo approccio non viene utilizzato nell'implementazione di Protein WISDOM poiché richiede un'elevata potenza computazionale. Riconoscendo i limiti delle risorse computazionali e la necessità di eseguire questi calcoli su potenzialmente centinaia o migliaia di sequenze durante la progettazione, Fung et al.¹⁷ hanno proposto un approccio più efficiente basato su TINKER/CYANA.^48-50 L'approccio prevede la definizione di un modello flessibile della struttura. Il modello flessibile può essere definito utilizzando limiti superiori e inferiori sulle distanze tra gli atomi C^α , nonché sugli angoli ϕ e ψ dei residui. Per una singola struttura, si utilizzano le distanze iniziali e gli angoli diedri, e i limiti vengono definiti come una distanza fissa o una percentuale. I limiti predefiniti sono ±10% per le distanze tra atomi C^α o ±10° per gli angoli diedri. Per un modello flessibile, i limiti possono essere ottenuti dai valori massimi e minimi osservati in tutte le strutture modello fornite in ingresso alla progettazione. Una volta definiti i limiti iniziali per ciascuna sequenza, vengono generati insiemi contenenti centinaia di conformeri utilizzando CYANA 2.1.^48,49 I conformeri vengono generati mediante un protocollo di ricottura simulata in dinamica degli angoli di torsione in CYANA, che riscalda rapidamente la proteina e la raffredda lentamente, registrando le conformazioni campionate. Al termine della ricottura simulata, viene eseguita una minimizzazione locale dell'energia per ridurre le sovrapposizioni tra i raggi di Van der Waals, nonché le violazioni dei vincoli di distanza e di angolo. Per impostazione predefinita, vengono generati 500 conformeri finali. Ogni struttura nell'insieme per ciascuna sequenza viene sottoposta a una minimizzazione locale in TINKER 3.6,⁵⁰ utilizzando il campo di forza AMBER.⁵¹ L'energia potenziale finale di ciascuna struttura minimizzata viene registrata in una tabella. Questo approccio generale viene applicato sia alla sequenza iniziale che a ciascuna sequenza mutante candidata. Successivamente, la Specificità di Ripiegamento di ciascuna sequenza mutante rispetto al ripiegamento bersaglio può essere calcolata in relazione alla sequenza nativa utilizzando la seguente distribuzione di Boltzmann (Eq. 4).

Stima dell'affinità di legame: Il metodo di calcolo approssimato dell'affinità di legame viene utilizzato per ordinare le sequenze progettate che sono in complesso con una proteina bersaglio. Questi calcoli possono essere eseguiti direttamente sulle sequenze ottenute dalla Fase Uno oppure sulle sequenze con elevata specificità di ripiegamento ottenute dal passaggio di specificità del ripiegamento.

Lilien et al.⁵² hanno proposto un approccio per il calcolo delle affinità di legame approssimate di complessi proteina-ligando. Tale metodo si basa sulla generazione di ensemble basati su rotameri della proteina, del ligando e del complesso proteina-ligando, e sull'utilizzo di questi ensemble per calcolare le funzioni di partizione. Questa affinità di legame approssimata è indicata con K* e definita dall'equazione 5.

Qui q_PL è la funzione di partizione del complesso proteina-legante, q_b è la funzione di partizione della proteina libera, e q_L è la funzione di partizione del ligando libero. Le funzioni di partizione sono definite nell'Eq. 6, dove gli insiemi B, F e L contengono rispettivamente le conformazioni basate sui rotameri del complesso proteina-ligando legato, della proteina libera e del ligando libero. E_n è l'energia della conformazione n, R è la costante dei gas, e T è la temperatura.

Previsione della struttura: Per iniziare il calcolo di K*, è necessaria una struttura tridimensionale di ciascuna sequenza. Questo viene effettuato utilizzando la funzione Rosetta AbRelax,^53-55 parte del pacchetto software Rosetta 3.4. La strategia alla base dell'algoritmo AbRelax si basa sull'osservazione sperimentale che la struttura locale della proteina è influenzata, ma non univocamente determinata, dalla sequenza locale della proteina. Viene utilizzato un algoritmo Monte Carlo per sostituire le strutture locali della proteina con frammenti strutturali derivati dalla sequenza. Questo metodo produce le strutture proteiche compatte finali, tenendo conto di interazioni non locali come residui idrofobici sepolti, filamenti β appaiati e interazioni specifiche tra catene laterali.

Raggruppamento: Le strutture ottenute da AbRelax vengono quindi raggruppate in base ai loro angoli φ e ψ utilizzando OREO.^56,57 Questo metodo di raggruppamento chiarisce le strutture representative del tronco principale dell'intero insieme strutturale. Le strutture medie dei dieci gruppi più grandi e la struttura con energia complessivamente più bassa vengono selezionate per il docking con la proteina bersaglio. Ciò fornisce 11 strutture uniche del tronco principale per ogni sequenza peptidica, incorporando la flessibilità del tronco principale nella generazione dell'insieme.

Previsione del docking: La previsione del docking viene effettuata utilizzando RosettaDock.^58-60 Per ogni sequenza, ciascuna delle 11 strutture della conformazione peptidica viene dockata contro la proteina bersaglio. In questo caso, poiché il sito di legame è noto, i peptidi vengono posizionati vicino al sito di legame e viene consentito loro di traslare di 3 Å in direzione normale rispetto al sito di legame, di 8 Å in direzione parallela al sito di legame e di ruotare di 8°. RosettaDock utilizza un algoritmo Monte Carlo per movimenti di docking a bassa e alta risoluzione. Ogni esecuzione di docking genera un ampio insieme di strutture complesse. I dieci complessi con energia più bassa di ciascuna delle 11 esecuzioni vengono utilizzati come strutture iniziali nella generazione finale dell'insieme conformazionale basato sui rotameri (110 strutture iniziali per sequenza).

Generazione dell'insieme finale: RosettaDesign⁶¹ viene utilizzato per generare l'insieme finale di conformazioni basato sui rotameri, poiché consente di produrre numerose strutture modificando esclusivamente i rotameri delle catene laterali mediante la funzione fixbb. A RosettaDesign vengono fornite diverse strutture iniziali e, per ciascuna struttura, un residuo viene scelto casualmente e il relativo rotamero viene modificato attraverso un algoritmo Monte Carlo. Questo procedimento viene ripetuto finché non vengono tentate migliaia di sostituzioni di rotameri, ottenendo così una conformazione finale a bassa energia che contribuirà in modo significativo alla funzione di partizione.

Per generare l'insieme di peptidi, le dieci strutture peptidiche con energia più bassa di ciascuno dei dieci cluster più grandi, insieme alle dieci strutture peptidiche complessivamente più stabili, vengono utilizzate come strutture iniziali per RosettaDesign (110 strutture iniziali in totale). Per ciascuna struttura iniziale vengono generate 200 conformeri rotamerici, ottenendo un insieme finale di 22.000 strutture (insieme L nell'Eq. 6). Questo insieme incorpora sia la flessibilità del backbone sia la flessibilità rotamerica.

L'insieme complesso viene generato in modo analogo, prendendo le 110 strutture iniziali dal passaggio di previsione del docking e generando 200 conformeri rotamerici per ciascuna struttura iniziale. La dimensione finale dell'insieme è di 22.000 strutture (insieme B nell'Eq. 6). La flessibilità viene considerata attraverso le diverse strutture del backbone peptidico utilizzate, le diverse conformazioni dockate e i conformeri rotamerici per ciascuna struttura iniziale.

L'insieme proteico viene generato eseguendo RosettaDesign sulla sola struttura della proteina bersaglio. In questo caso, vengono generate 2.000 conformazioni di rotamero a partire da un'unica struttura iniziale, pertanto la dimensione finale dell'insieme è di 2.000 strutture (insieme F nell'Eq. 6).

Proteina WISDOM

Protein WISDOM, acronimo di Protein Workbench for In Silico De novo design Of bioMolecules, è uno strumento online che offre alla comunità accademica accesso in modo user-friendly al nostro framework per la progettazione de novo di proteine. Può gestire diversi obiettivi di progettazione comunemente riscontrati, dalla progettazione di singole catene proteiche per adottare un ripiegamento modello fino alla progettazione di nuovi peptidi in grado di legarsi a una proteina bersaglio. Le prossime due sezioni descrivono le capacità di Protein WISDOM riguardo ai due principali tipi di problemi di progettazione proteica incontrati. Il primo tipo applica la selezione di sequenza per scegliere nuove sequenze favorevoli nel modello di progettazione fornito e poi utilizza la specificità del ripiegamento per convalidare le nuove sequenze. Il secondo tipo utilizza la selezione di sequenza per scegliere nuove sequenze di un peptide legato in un complesso e poi impiega sia la specificità del ripiegamento sia calcoli approssimativi dell'affinità di legame per convalidare le nuove sequenze.

Registrazione dell'utente

Visitare la pagina web di Protein WISDOM all'indirizzo http://www.proteinwisdom.org.

Fare clic sul pulsante Accesso utente in alto a destra nella pagina. Fare clic su "Clicca qui" per registrarsi.

Compilare le informazioni relative all'indirizzo email e al nome utente richiesto, quindi fare clic su continua.

Compilare le informazioni aggiuntive su nome, istituzione, gruppo e indirizzo. Selezionare la casella di controllo per accettare i termini di utilizzo. Fare clic sul pulsante "Invia registrazione".

Fase uno: Selezione della sequenza

Invio della sequenza proteica e della struttura(i) modello

Fare clic sul pulsante Accesso utente per iniziare l'esperimento di progettazione delle proteine. Viene presentata all'utente la sua "Pagina iniziale utente" (Figura 3) che mostra il numero di lavori inviati, il numero di strutture (modelli) caricate e un elenco delle strutture caricate fino ad ora.

Avviare un nuovo lavoro di progettazione facendo clic su "Crea nuovo lavoro". L'utente viene indirizzato alla pagina "Invio lavoro" (Figura 4). Assegnare un nome al lavoro e indicare se è basato su un lavoro precedente (ovvero lo stesso modello di progettazione, set di mutazioni e vincoli biologici possono essere importati in un nuovo lavoro, tuttavia l'utente potrà modificare i set di mutazioni e i vincoli biologici). Fare clic su "continua".

Caricare la/e struttura/e proteica/e del modello di progettazione (Figura 5). Questo modello deve essere in formato standard del Protein Data Bank (PDB). Può trattarsi di un modello rigido (un unico insieme di coordinate per ogni atomo) o di un modello flessibile (più modelli, come quelli ottenuti da strutture in soluzione NMR). Nel caso della progettazione di una singola proteina, il modello deve contenere un'unica catena. L'utente può caricare un nuovo modello oppure selezionarne uno esistente tra quelli precedentemente caricati. Indicare facoltativamente l'ID pdb del modello, se disponibile. Se vengono caricati più modelli, assicurarsi che ciascun modello inizi con "MODEL #" e termini con "ENDMDL". Verificare che ogni residuo sia assegnato a un amminoacido naturale. Fare clic su "Continua".

Dopo il caricamento corretto del modello, Protein WISDOM mostrerà il numero di residui, catene e modelli trovati nel modello, elencherà la sequenza e chiederà all'utente di verificare il modello. Confermare la struttura del modello se è stata inserita correttamente e fare clic su "Continua".

Una volta caricato e confermato correttamente il modello, l'utente viene indirizzato alla "Pagina Principale di Controllo" (Figura 6). In questa pagina, l'utente può visualizzare lo stato del processo, modificare i set di mutazioni e i vincoli biologici, e inviare il processo per la Fase Uno: Selezione della Sequenza. A questo punto, poiché la Fase Uno non è ancora completata, non sono disponibili opzioni per la Fase Due. Tali opzioni diventano accessibili solo una volta disponibili i risultati della Fase Uno.

Selezione di insiemi di mutazioni

Fare clic sul collegamento "Set di mutazioni" nella "Pagina di controllo principale" per definire i set di mutazioni.

Selezionare quali residui potranno subire mutazioni e quali aminoacidi potranno formarsi in seguito alla mutazione (Figura 7). Per impostazione predefinita, gli aminoacidi consentiti in ogni posizione sono scelti in base all'Area della Superficie Accessibile al Solvente (SASA). È obbligatorio definire i set di mutazioni.

Fare clic su "Salva modifiche" dopo aver selezionato i set di mutazioni. L'utente può scegliere di continuare a modificare il set di mutazioni. Al termine della modifica del set di mutazioni, fare clic per tornare alla "Pagina di controllo principale".

Selezione dei vincoli biologici

Fare clic sul collegamento "Vincoli biologici" nella "Pagina principale di controllo" per definire i vincoli biologici.

Specifica vincoli relativi alla carica o al contenuto di aminoacidi in tutta la proteina o in una porzione della proteina (Figura 8).

Limitare il numero totale di mutazioni che possono verificarsi, se necessario. I vincoli biologici sono opzionali. Fare clic per tornare alla "Pagina di controllo principale" al termine.

Invio della Fase Uno: Selezione della Sequenza

Fare clic sul collegamento "Begin Stage 1" per portare l'utente alla pagina "Submit Stage 1".

Selezionare la catena da progettare (Figura 9), il numero di sequenze da generare, il campo forza dipendente dalla distanza e il modello. Se si sta progettando un complesso e si desidera un calcolo della Specificità di Ripiegamento, si deve scegliere una sola catena da progettare. Se il modello caricato era una singola struttura o un "modello rigido", è consentito solo il modello a Struttura Singola. Se il modello caricato è flessibile, l'utente può scegliere tra tutti e tre i modelli: Struttura Singola, Media Ponderata e Bin di Distanza. Prestare attenzione alla complessità computazionale dell'ottimizzazione da risolvere. È previsto un limite superiore di 20²⁵ per la complessità computazionale consentita.

Invia il lavoro. L'utente viene reindirizzato alla "Pagina di Controllo Principale" (Figura 10). Lo stato del lavoro verrà aggiornato per indicare l'andamento corrente del processo. Dopo l'invio, il lavoro risulterà bloccato per modifiche.

Al termine del processo, l'utente riceve un'e-mail con i risultati, costituiti da un elenco di sequenze progettate. I risultati sono inoltre visualizzabili sulla "Pagina di Controllo Principale". Sulla pagina appare una casella per la Fase 2: Specificità della Piega, che consente all'utente di eseguire questa verifica.

Fase Due: Calcoli della Specificità di Piega

Invio per specificità della piegatura

Fare clic su "Inizia Fase 2: Specificità del Piega" per accedere alla pagina "Fase di Costruzione 2". Definire i limiti superiore e inferiore della distanza tra C^α-C^α specificando il fattore di flessibilità del modello, sia come percentuale della distanza, sia come distanza fissa. Definire i limiti angolari superiore e inferiore per gli angoli diedri φ e ψ specificando il fattore di flessibilità del modello come percentuale. Si noti che, quando si utilizza un modello flessibile, i limiti di distanza superiore e inferiore vengono determinati rispettivamente come i valori di distanza più bassi e più alti tra tutti i modelli del modello. Analogamente, i limiti angolari superiore e inferiore vengono ricavati dai valori angolari più alti e più bassi tra tutti i modelli.

Fare clic sul pulsante "Submit".

Specificare il numero di strutture da generare per ogni sequenza e fare clic su "Continua". Si noti che il limite massimo è di 500 strutture per sequenza da generare.

Fare clic su "Continue" per confermare l'intenzione di inviare la richiesta per la validazione della piegatura. La Fase Uno e la Fase Due sono bloccate per la modifica fino al completamento della Fase Due.

Al termine del processo, all'utente viene inviata un'e-mail con i risultati. Visualizzare i risultati su Protein WISDOM nella "Pagina di controllo principale" (Figura 11). Qui è possibile visualizzare e scaricare i file di testo contenenti le sequenze progettate, i corrispondenti valori energetici della Fase Uno e i valori di specificità della piega della Fase Due. Inoltre, l'utente può fare clic sul collegamento "Visualizza risultati", che mostra nel browser una tabella con i punteggi e i valori energetici della Fase Uno, nonché i punteggi e i valori di specificità della piega della Fase Due.

Fase Tre: Calcoli Approssimativi dell'Affinità di Legame per Complessi Proteina-peptide

I calcoli dell'affinità di legame approssimativa determinano l'affinità della proteina o del peptide legante progettato verso il resto del complesso. Questi calcoli possono essere eseguiti direttamente dopo la Fase Uno, oppure dopo il completamento dei calcoli di specificità della piega.

Fare clic su "Sequence #" per selezionare la sequenza con cui iniziare il calcolo approssimativo dell'affinità di legame. L'utente verrà indirizzato alla pagina "Select Sequence", che mostra un elenco delle sequenze progettate insieme ai loro punteggi di selezione della sequenza e di specificità della piega. È possibile selezionare una sola sequenza alla volta per il calcolo approssimativo dell'affinità di legame, poiché i calcoli richiedono un'elevata potenza computazionale. Al termine dell'elaborazione di una sequenza, l'utente potrà selezionarne un'altra per calcolarne l'affinità di legame approssimativa; questo risultato verrà aggiunto al precedente, mostrando l'affinità di legame approssimativa per tutte le sequenze completate. Una volta selezionata e salvata una sequenza, l'utente verrà reindirizzato alla "Main Control Page".

Fare clic su "Inizia Fase 2: Affinità di legame approssimativa" per inviare il processo. Al termine, i risultati vengono inviati all'utente tramite e-mail, inclusa una scheda contenente il numero di sequenza, l'affinità di legame approssimativa e i valori delle funzioni di partizione nell'Eq. 6. Per ogni successivo processo di affinità di legame approssimativa, questo file contiene i risultati di tutte le sequenze completate. I risultati completi (dalla selezione della sequenza, specificità di ripiegamento e affinità di legame approssimativa) possono essere visualizzati accedendo alla "Pagina di controllo principale" del processo (Figura 12).

Risultati

Progettazione De Novo di Inibitori dell'Entrata per l'HIV-1

Il framework di progettazione de novo implementato in Protein WISDOM è stato utilizzato per la progettazione di peptidi inibitori per diversi importanti sistemi terapeutici (Tabelle 1 e 2). Un sistema particolarmente rilevante è la progettazione di peptidi in grado di inibire l’ingresso dell’HIV-1 nel recettore cellulare ospite CD4, qui utilizzato come sistema rappresentativo per dimostrare l’utilizzo p...

Discussione

Il framework di progettazione delle proteine de novo è costituito da due fasi, una fase di selezione della sequenza e una fase di convalida. Il framework è sufficientemente robusto da gestire modelli di progettazione rigidi e flessibili e può essere applicato a progetti di proteine singole o complesse. Il framework è stato applicato con successo a numerosi sistemi proteici con applicazioni a dozzine di malattie. Un certo numero di disegni sono stati convalidati sperimentalmente, fornendo i più potenti inibitori ...