Differenziazione del neonato mouse pelle cellule staminali derivate in cellule germinali-simili<em&gt; In vitro</em

Sommario

Negli ultimi anni la formazione di cellule germinali utilizzando metodi in coltura in vitro è stata dimostrata utilizzando diversi tipi di cellule staminali somatiche. Questo articolo presenta visivamente la differenziazione delle cellule staminali derivate topo neonato per primi cellule ovocita-like.

Abstract

Studiare la formazione delle cellule germinali e la differenziazione è sempre stato molto difficile a causa di un basso numero di cellule e la loro posizione nel profondo di sviluppo degli embrioni. La disponibilità di un "chiuso" nel sistema basato vitro potrebbe rivelarsi prezioso per la nostra comprensione della gametogenesi. La formazione di ovociti-come le cellule (oLc) da cellule staminali somatiche, isolate dalla pelle neonato topo, è stata dimostrata e può essere visualizzato in questo protocollo video. Le oLc risultanti esprimono vari marker coerenti con gli ovociti come Oct4, Vasa, BMP15 e SCP3. Tuttavia, rimangono in grado di sottoporsi a maturazione o la fecondazione a causa di un mancato completamento della meiosi. Questo protocollo fornirà un sistema che è utile per studiare la formazione fase iniziale e la differenziazione delle cellule germinali in gameti più mature. Durante precoce differenziazione del numero di cellule che esprimono Oct4 (potenziali cellule germinali-simili) raggiunge ~ 5%, tuttavia attualmente il formazione delle oLc rimane relativamente inefficiente. Il protocollo è relativamente semplice ma particolare cura deve essere presa per assicurare la popolazione di cellule di partenza è sano e ad un passaggio precoce.

Introduzione

Durante l'embriogenesi precoce, gametogenesi avviene attraverso una serie di tappe tra cui cellule germinali primordiali (PGC) formazione, migrazione, e, infine, la colonizzazione delle creste delle gonadi. Durante questo periodo PGC subiscono proliferazione e differenziazione in sempre gameti più mature ^1. Il fatto che il PGC migrano dalla base del allantoide nella hindgut embrione e infine lungo la parete dorsale finalmente colonizzando le creste delle gonadi li rende estremamente difficile da studiare ^2. Nonostante i progressi nel campo, gli studi che tentano di comprendere la formazione PGC e differenziazione sono stati ostacolati dal lo....

Protocollo

1. Media Preparazione

1. Preparare i media 2-3 ore in anticipo di utilizzo e luogo con un tappo allentato nella cultura incubatore cella in cui l'esperimento avrà luogo. Supporti utilizzati nel presente protocollo:
   1. Preparare staminali mezzo cella costituita dal DMEM/F12 addizionato con 1 x B27, 40 ng / ml bFGF, e 20 ng / ml EGF.
   2. Preparare cellule germinali terreno di differenziamento composto M199 addizionato con 0,05 UI di FSH, LH 0,03 IU, 3 mg / ml BSA, 5 microlitri / ml ITS, 0,23 mM di piruvato di sodio, 1 mg / ml Fetuina, e 1 ng / ml EGF. Un mezzo base costituita da tutti gli additivi ma omettendo FSH, LH e EGF può essere preparata ....

Risultati

Inizialmente le cellule attribuiscono alla cultura piatto fondo e sparsi. A 42-72 ore in differenziazione piccoli sospesi OCT4 cellule positive formano e proliferano (Figura 1A). Poco dopo la visualizzazione di queste cellule maggioranza scompare e le cellule attaccate formerà aggregati colonia dense sul fondo cultura. A seguito di un paio di giorni questi aggregati si staccano dalla superficie cultura. In alcuni di questi aggregati può osservare una grande cella (Figura 1b e 1c.......

Discussione

Ad oggi oLc funzionali non sono stati sviluppati utilizzando una completamente in vitro. Recentemente uno studio condotto da Hayashi et al. Era in grado di produrre prole da PGC-come le cellule formati in vitro e trasferimento in vivo per un ulteriore sviluppo ^14. Partendo da cellule ES o cellule pluripotenti indotte sono stati in grado di formare PGC come le cellule che, una volta recuperati a seguito di trapianto in vivo sono stati in grado di essere maturato, fe.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM/F12	Invitrogen	12500
B27	Invitrogen	17504044
EGF	Invitrogen	PHG0311
bFGF	Invitrogen	PHG0266
ITS	Invitrogen	41400-045
BSA	Sigma	A-6003
Piruvato di sodio	Invitrogen	11360-070
Fetuin	Sigma	F3385
FSH	Sioux Biochemicals	915
LH	Sioux Biochemicals	925
M199	Invitrogen	31100-035
Piastre a 24 pozzetti	Nunc	144530
Piastre da 10 cm	VWR	25384-088
15 ml tubi	BD	352095