Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) dei soggetti debolmente di scattering

Sommario

Le posizioni tridimensionali di oggetti debolmente scattering possono essere identificati univocamente tramite linea digitale microscopia olografica (DIHM), che comporta una modifica minore ad un microscopio standard. Il nostro software utilizza un semplice euristica di imaging accoppiato con Rayleigh-Sommerfeld back-propagation cedere la posizione tridimensionale e la geometria di un oggetto fase microscopico.

Abstract

Oggetti debolmente di scattering, come piccole particelle colloidali e la maggior parte delle cellule biologiche, si incontrano spesso in microscopia. Infatti, una serie di tecniche sono state sviluppate per visualizzare meglio questi oggetti di fase; contrasto di fase e DIC sono tra i metodi più diffusi per migliorare il contrasto. Tuttavia, la posizione di registrazione e la forma in direzione out-of-imaging-plane rimane difficile. Questa relazione introduce un semplice metodo sperimentale per determinare con precisione la posizione e la geometria di oggetti in tre dimensioni, utilizzando la microscopia olografica digitale inline (DIHM). In generale, il volume del campione accessibile è definita dalla dimensione del sensore telecamera nella direzione laterale, e la coerenza illuminazione nella direzione assiale. Volumi di campione tipiche vanno da 200 micron x 200 micron x 200 micron con illuminazione a LED, per5 millimetri x 5 mm x 5 mm o superiore in illuminazione laser. Questa luce di illuminazione è configurato in modo che le onde piane sono incidenti sul campione. Oggetti nel volume del campione poi diffondono la luce, che interferisce con la luce unscattered per formare modelli di interferenza perpendicolare alla direzione di illuminazione. Questa immagine (l'ologramma) contiene le informazioni profondità richiesta per ricostruzione tridimensionale, e può essere catturata su un dispositivo di imaging quali uno CMOS o CCD. Il metodo Back Propagation Rayleigh-Sommerfeld è impiegato per rifocalizzare numericamente immagini al microscopio, e una semplice euristica di imaging basata sulla fase Gouy anomalia viene utilizzato per identificare spargendo oggetti all'interno del volume ricostruito. Questo metodo semplice e robusto risulta in un, misura univoca senza modello della posizione e forma degli oggetti in campioni microscopici.

Introduzione

Linea digitale microscopia olografica (DIHM) permette veloce l'imaging tridimensionale di campioni microscopici, quali microrganismi nuoto ^1,2 e sistemi di materia morbidi ^3,4, con modifiche minime a una configurazione microscopio standard. In questo documento viene fornita una dimostrazione pedagogica di DIHM, incentrata su software sviluppato nel nostro laboratorio. Questo documento contiene una descrizione di come impostare il microscopio, ottimizzare l'acquisizione dei dati, ed elaborare le immagini registrate per ricostruire i dati tridimensionali. Il software (basato in parte su software sviluppato dalla DG Grier e altri ⁵⁾

Protocollo

1. Setup and Data Acquisition

1. Far crescere una cultura di Streptococcus ceppo V4051-197 (nuoto liscio), le cellule in KTY medio da congelato magazzino ^22. Incubare in un agitatore rotativo notte a 35 ° C e 150 rpm, a saturazione.
2. Inoculare 10 ml di mezzo fresco KTY con 500 microlitri della cultura satura. Incubare per un ulteriore 3,5 ore a 35 ° C e 150 rpm fino a quando le cellule raggiungono una densità ottica di circa 1,0 a λ = 600 nm (circa 5 x 10 ⁸ cellule / ml).
3. Diluire 1:400 in mezzi freschi per ottenere la concentrazione finale di cellule mobili.
4. Su un vetrino da microscopio, fare un anel....

Risultati

Per dimostrare le capacità di DIHM, esperimenti sono stati eseguiti su una catena di batteri Streptococcus. La catena stessa misurato 10,5 millimetri lungo, ed era composta di 6-7 cellule sferico cilindrico (due delle cellule della catena sono vicini a dividere) con diametri nell'intervallo 0,6-1 micron. Figure 1a e 1b mostrano l'interfaccia principale della ricostruzione e del software di rendering. Esempi del procedimento rifocalizzazione numerico si vedono nella

Discussione

Il passo più importante in questo protocollo sperimentale è la cattura accurata di immagini da un setup sperimentale stabile. Con scarsi dati di base, ad alta ricostruzione fedeltà è quasi impossibile. E 'anche importante evitare lenti dell'obiettivo con un elemento di contrasto di fase interna (visibile come un anello scuro quando guardando attraverso il posteriore dell'obiettivo), in quanto questo può degradare l'immagine ricostruita. L'oggetto di interesse deve essere sufficientemente lontana dal .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microscopio invertito Nikon Eclipse Ti-E	Nikon Corp.
di emissione LED	Thorlabs	M660L3	λ=660 nm, larghezza di linea circa 20 nm
alimentatore elettrico LED	Thorlabs	LEDD1B
Adattatore filettato	Thorlabs	SM2T2
Adattatore filettato	Thorlabs	SM1A2
Scheda Frame Grabber	EPIX	PIXCI E4
Telecamera CMOS ad alta velocità	Mikrotron	MC-1362

Lunghezza d'onda