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Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) dei soggetti debolmente di scattering

DOI:

10.3791/50488

February 8th, 2014

In This Article

Summary

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Le posizioni tridimensionali di oggetti debolmente scattering possono essere identificati univocamente tramite linea digitale microscopia olografica (DIHM), che comporta una modifica minore ad un microscopio standard. Il nostro software utilizza un semplice euristica di imaging accoppiato con Rayleigh-Sommerfeld back-propagation cedere la posizione tridimensionale e la geometria di un oggetto fase microscopico.

Abstract

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Oggetti debolmente di scattering, come piccole particelle colloidali e la maggior parte delle cellule biologiche, si incontrano spesso in microscopia. Infatti, una serie di tecniche sono state sviluppate per visualizzare meglio questi oggetti di fase; contrasto di fase e DIC sono tra i metodi più diffusi per migliorare il contrasto. Tuttavia, la posizione di registrazione e la forma in direzione out-of-imaging-plane rimane difficile. Questa relazione introduce un semplice metodo sperimentale per determinare con precisione la posizione e la geometria di oggetti in tre dimensioni, utilizzando la microscopia olografica digitale inline (DIHM). In generale, il volume del campione accessibile è definita dalla dimensione del sensore telecamera nella direzione laterale, e la coerenza illuminazione nella direzione assiale. Volumi di campione tipiche vanno da 200 micron x 200 micron x 200 micron con illuminazione a LED, per5 millimetri x 5 mm x 5 mm o superiore in illuminazione laser. Questa luce di illuminazione è configurato in modo che le onde piane sono incidenti sul campione. Oggetti nel volume del campione poi diffondono la luce, che interferisce con la luce unscattered per formare modelli di interferenza perpendicolare alla direzione di illuminazione. Questa immagine (l'ologramma) contiene le informazioni profondità richiesta per ricostruzione tridimensionale, e può essere catturata su un dispositivo di imaging quali uno CMOS o CCD. Il metodo Back Propagation Rayleigh-Sommerfeld è impiegato per rifocalizzare numericamente immagini al microscopio, e una semplice euristica di imaging basata sulla fase Gouy anomalia viene utilizzato per identificare spargendo oggetti all'interno del volume ricostruito. Questo metodo semplice e robusto risulta in un, misura univoca senza modello della posizione e forma degli oggetti in campioni microscopici.

Introduction

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Linea digitale microscopia olografica (DIHM) permette veloce l'imaging tridimensionale di campioni microscopici, quali microrganismi nuoto 1,2 e sistemi di materia morbidi 3,4, con modifiche minime a una configurazione microscopio standard. In questo documento viene fornita una dimostrazione pedagogica di DIHM, incentrata su software sviluppato nel nostro laboratorio. Questo documento contiene una descrizione di come impostare il microscopio, ottimizzare l'acquisizione dei dati, ed elaborare le immagini registrate per ricostruire i dati tridimensionali. Il software (basato in parte su software sviluppato dalla DG Grier e altri 5)

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Protocol

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1. Setup and Data Acquisition

  1. Far crescere una cultura di Streptococcus ceppo V4051-197 (nuoto liscio), le cellule in KTY medio da congelato magazzino 22. Incubare in un agitatore rotativo notte a 35 ° C e 150 rpm, a saturazione.
  2. Inoculare 10 ml di mezzo fresco KTY con 500 microlitri della cultura satura. Incubare per un ulteriore 3,5 ore a 35 ° C e 150 rpm fino a quando le cellule raggiungono una densità ottica di circa 1,0 a λ = 600 nm (circa 5 x 10 8 cellule / ml).
  3. Diluire 1:400 in mezzi freschi per ottenere la concentrazione finale di cellule mobili.
  4. Su un vetrino da microscopio, fare un anel....

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Results

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Per dimostrare le capacità di DIHM, esperimenti sono stati eseguiti su una catena di batteri Streptococcus. La catena stessa misurato 10,5 millimetri lungo, ed era composta di 6-7 cellule sferico cilindrico (due delle cellule della catena sono vicini a dividere) con diametri nell'intervallo 0,6-1 micron. Figure 1a e 1b mostrano l'interfaccia principale della ricostruzione e del software di rendering. Esempi del procedimento rifocalizzazione numerico si vedono nella figu.......

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Discussion

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Il passo più importante in questo protocollo sperimentale è la cattura accurata di immagini da un setup sperimentale stabile. Con scarsi dati di base, ad alta ricostruzione fedeltà è quasi impossibile. E 'anche importante evitare lenti dell'obiettivo con un elemento di contrasto di fase interna (visibile come un anello scuro quando guardando attraverso il posteriore dell'obiettivo), in quanto questo può degradare l'immagine ricostruita. L'oggetto di interesse deve essere sufficientemente lontana dal .......

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgements

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Gli autori ringraziano Linda Turner per l'assistenza con la preparazione microbiologica. RZ e LGW sono stati finanziati dall'Istituto Rowland ad Harvard e CGB è stato finanziato come studioso di una Fondazione CAPES, Scienza Senza Frontiere Programma, Brasile (Processo # 7340-11-7)

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Microscopio invertito Nikon Eclipse Ti-ENikon Corp. 
di emissione LEDThorlabsM660L3λ=660 nm, larghezza di linea circa 20 nm 
alimentatore elettrico LEDThorlabsLEDD1B 
Adattatore filettatoThorlabsSM2T2 
Adattatore filettatoThorlabsSM1A2 
Scheda Frame GrabberEPIXPIXCI E4 
Telecamera CMOS ad alta velocitàMikrotronMC-1362 
Lunghezza d'onda

References

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  1. Xu, W., Jericho, M. H., Meinertzhagen, I. A., Kreuzer, H. J. Digital in-line holography for biological applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (20), 11301-11305 (2001).
  2. Sheng, J., Malkiel, E., Katz, J., Adolf, J., Belas, R., Place, A. R.

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Digital Inline Holographic Microscopy3D ReconstructionHolographic ImagingRayleigh Sommerfeld Back PropagationGouy Phase AnomalyLabel Free Volumetric ImagingBacterial Cell TrackingConfocal Microscopy ComparisonLED Illumination SetupCMOS Camera Capture

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