Tripsina digest è uno dei metodi più comunemente utilizzati per analizzare vascolarizzazione retinica. Questo manoscritto descrive il metodo in dettaglio, comprese le alterazioni fondamentali per ottimizzare la tecnica e rimuovere il tessuto non vascolare preservando l'architettura generale dei vasi.
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Articolo metodologico
Tripsina Digest protocollo per analizzare la vascolarizzazione della retina di un modello murino
In questo articolo
Sommario
Abstract
Tripsina digest è il metodo gold standard per analizzare la retina vascolare 1-5. Permette la visualizzazione di tutta la rete di vasi complessi tridimensionali sanguigni e capillari retinici creando una bidimensionale TV a monte dei canali vascolari interconnessi dopo digestione dei componenti non vascolari della retina. Questo permette di studiare le varie alterazioni patologiche vascolari, come microaneurismi, degenerazione capillare e abnorme endoteliali ai rapporti di periciti. Tuttavia, il metodo è tecnicamente impegnativo, soprattutto nei topi, che sono diventati il modello animale più ampiamente disponibile per studiare la retina a causa della facilità di manipolazioni genetiche 6,7. Nell'occhio topo, è particolarmente difficile da rimuovere completamente i componenti non vascolari mantenendo l'architettura complessiva dei vasi sanguigni della retina. Ad oggi, vi è una carenza di letteratura che descrive la tecnica tripsina digest in dettaglio in il mouse. Questo manoscritto fornisce una metodologia dettagliata passo-passo della tripsina digest nel topo retina, fornendo anche suggerimenti sulla risoluzione dei passaggi difficili.
Introduzione
Visualizzare la vascolarizzazione della retina è un approccio estremamente importante per sezionare i meccanismi delle varie malattie oculari come la retinopatia diabetica. Essa permette di valutare le prime anomalie vascolari, tra cui microaneurismi, degenerazione dei capillari, e perdita pericyte 8,9. Ad oggi, sono state sviluppate diverse tecniche per analizzare la vascolarizzazione della retina. Perfusione di vari coloranti è stato utilizzato per evidenziare i vasi, ma tutti hanno condiviso limitazioni simili. Iniezione evidenzia raramente l'intero sistema vascolare della retina a meno dato ad alta pressione, che rischia di rompersi e danneggiare l....
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Protocollo
1. Preparazione della retina
- Enucleare l'occhio mouse. Con una sola mano, aprire le palpebre in modo che l'occhio è visibile. Con l'altra mano, utilizzando una pinza curva (curva rivolta verso l'alto), applicare una pressione su aspetti superiore e inferiore dell'orbita fino sporge globo. Chiudere delicatamente forcipe nel lato posteriore dell'occhio e sollevare in un movimento continuo di enucleare l'occhio.
- Fissare gli occhi con il 10% formalina tamponata neutra per almeno 24 ore.
- Luogo occhio in soluzione PBS in una piccola scatola di Petri.
- Sezionare retina attentamente al microscopio, facendo a....
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Risultati
Il prodotto finale di una procedura di successo è una TV a monte di tutta la rete del mouse vascolarizzazione della retina, con l'architettura mantenuto, colorate sia con PAS / ematossilina o H & E, come mostrato nelle figure 2-4. Chiara differenziazione delle cellule endoteliali e periciti può essere visto come mostrato in Figura 3. Nella retina, i nuclei delle cellule endoteliali sono ovali o allungata e si trova interamente all'interno della parete del vaso. Nuclei perici.......
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Discussione
Tripsina digest è un metodo standard per valutare la vascolarizzazione della retina. Purtroppo è tecnicamente impegnativo e può causare elevato tasso di perdita di campione, se non eseguite correttamente. Inoltre, la procedura è particolarmente difficile nei topi, che può limitare l'applicazione di questa tecnica nei comunemente utilizzati modelli animali genetici di malattie oculari. Questo documento fornisce una guida su come eseguire la procedura efficace e coerente con gli occhi del mouse.
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal NIH RO1-EY019951 (AAF), Illinois Società per la Prevenzione della Cecità (JCC, AAF), i fondi non vincolati al Dipartimento di Oftalmologia di ricerca per prevenire la cecità (RPB), NY e RPB Medical Student Fellowship di Grant (CCM).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| 10% formalina tamponata neutra | Fischer Scientific | SF100-4 | |
| Tripsina (1:250) | Amresco | 0458-50G | Produrre il 3% di tripsina in 0,1 M Tris |
| TRIZMA base | Sigma | T1503-1KG | Creare 0,1 M Tris Buffer (pH 7,8 @ 37 ° C) |
| TRIZMA | Sigma | T3253-500G | |
| Flacone sottovuoto sterile Steritop | Millipore | SCGPS05RE | Crea acqua |
| EQUIPMENT | |||
| Microscopio | Qualsiasi microscopio che consenta una buona visualizzazione della retina è adeguato. (10x è sufficiente con una distanza di lavoro di 24 mm) | ||
| Forbici dritte | Fine Science Tools | 15024-10 | Tagliente: 8 mm; Diametro della punta: 0,2 mm; 10 cm |
| Pinza dritta (Inox) | Dumont #5 | 11252-20 | Biologie tip; 0,05 x 0,02 mm; 11 cm |
| Curved Forcepts (Dumostar) | Dumont #7 | 11297-10 | Biologie tip; 0,07 x 0,04 mm; 11,5 cm |
| Dubnoff Metabolic Shaker Incubator | Precision Scientific | BDG59442 | Shaker opzionale Piatto da |
| 24 pozzetti | Falcon | ||
| Vetrini per microscopio | VWR | 82027-132 | |
Riferimenti
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Retinal vascular patterns. VII. Acellular change. Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).
- Bell, W. R., Gr....
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Ristampe e permessi
