Articolo metodologico

Caratterizzazione delle risposte infiammatorie durante la colonizzazione intranasale con streptococco pneumoniae

DOI:

10.3791/50490

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17 gennaio 2014

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1Department of Pathology and Molecule Medicine, McMaster University

In questo articolo

Sommario

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Viene descritta la colonizzazione del nasofaringe murino con streptococco pneumoniae e la successiva estrazione di cellule aderenti o reclutate. Questa tecnica prevede il lavaggio del nasofaringe e la raccolta del fluido attraverso i nares ed è adattabile per varie letture, tra cui la quantificazione differenziale delle cellule e l'analisi dell'espressione dell'mRNA in situ.

Abstract

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La colonizzazione nasofaringea da parte di Streptococcus pneumoniae è un prerequisito per l'invasione ai polmoni o al flusso sanguigno1. Questo organismo è in grado di colonizzare la superficie mucosa del rinofaringe, dove può risiedere, moltiplicarsi e infine superare le difese ospiti per invadere altri tessuti dell'ospite. L'accertamento di un'infezione nelle vie respiratorie normalmente inferiori provoca polmonite. In alternativa, i batteri possono diffondersi nel flusso sanguigno causando la batteriemia, che è associata ad alti tassi dimortalità 2, oppure portare direttamente allo sviluppo della meningite pneumococcica. Comprendere la cinetica e le risposte immunitarie alla colonizzazione nasofaringea è un aspetto importante dei modelli di infezione da S. pneumoniae.

Il nostro modello di topo di colonizzazione intranasale è adattato daimodelli umani 3 ed è stato utilizzato da più gruppi di ricerca nello studio delle risposte ospite-patogeno nel nasofaringe4-7. Nella prima parte del modello, usiamo un isolato clinico di S. pneumoniae per stabilire una colonizzazione batterica autolimitante che è simile agli eventi di trasporto negli adulti umani. La procedura qui dettagliata prevede la preparazione di un inoculo batterico, seguito dall'istituzione di un evento di colonizzazione attraverso la consegna dell'inoculo attraverso una via intranasale di somministrazione. I macrofagi residenti sono il tipo di cellula predominante nel nasofaringe durante lo stato stazionario. In genere, ci sono pochi linfociti presenti nei topi non infetti8, tuttavia la colonizzazione della mucosa porterà a infiammazioni di basso-alto grado (a seconda della virulenza delle specie batteriche e del ceppo) che si tradurrà in una risposta immunitaria e nel successivo reclutamento delle cellule immunitarie ospiti. Queste cellule possono essere isolate da un gabinetto del contenuto tracheale attraverso i narici e correlate alla densità dei batteri della colonizzazione per comprendere meglio la cinetica dell'infezione.

Protocollo

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Prima di iniziare: tutti i passaggi vengono eseguiti in un armadietto di sicurezza biologica (BSC) biohazard level 2 (BSL2) se non diversamente indicato. Assicurarsi di aver ottenuto l'approvazione a rischio biologico appropriata per l'uso di agenti patogeni batterici infettivi secondo le linee guida istituzionali prima dell'inizio degli esperimenti. Inoltre, assicurati di avere tutti i materiali e i reagenti necessari per condurre la procedura preparata in anticipo. I topi utilizzati in questi esperimenti hanno incluso topi C57BL/6 femminili dei Jackson Laboratories, Charles River o Taconic e avevano 10-14 settimane di età (anche se non abbiamo trova....

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Risultati

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La figura 1 rappresenta uno schema di panoramica che riassume i passaggi principali del protocollo. Le figure 2-3 forniscono la visualizzazione della metodologia microbiologica inerente ai protocolli descritti nel presente documento. La figura 4 rappresenta il corretto posizionamento di un topo per eseguire una colonizzazione intranasale, mentre la figura 5 descrive tipicamente i cambiamenti di peso dei topi colonizzati con ceppo S. pneumoniae P.......

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Discussione

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In questo studio abbiamo presentato metodi dettagliati per la colonizzazione intranasale dei topi utilizzando un ceppo isolato clinico di Streptococcus pneumoniae e il successivo isolamento e caratterizzazione delle cellule immunitarie reclutate in rinofaringe in risposta ai batteri. Abbiamo dimostrato come un inoculo batterico possa essere coltivato in mezzi ricchi di nutrienti e utilizzato per stabilire un evento di colonizzazione nei topi, che è inizialmente limitato al rinofaringe. Abbiamo quindi mostrato co.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano il Dr. Jeffery Weiser dell'Università della Pennsylvania per il suo dono dei ceppi clinici di Streptococcus pneumoniae. Questo lavoro è stato finanziato dal Canadian Institutes for Health Research. CV è stato finanziato da una borsa di studio M. G. DeGroote e da una borsa di studio della Canadian Thoracic Society. Questo lavoro è stato finanziato dalla Ontario Lung Association e dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Il lavoro nel laboratorio bowdish è supportato in parte dal Michael G. DeGroote Centre for Infectious Disease Research e dal McMaster Immunology Research Centre.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anti-topo Ly6C FITCBD Pharmingen553104
Anti-topo Ly6G PEBD Pharmingen
Anti-topo CD45.1 eFluor 450eBioscience48-0453-82
Anti-topo F4/80 Antigene APCeBioscience17-4801-82
Anti-topo CD11c PerCP-Cy5.5eBioscience45-0114-82
Anti-Mouse CD11b PE-Cy7eBioscience25-0112-82
Anti-Mouse CD3 Alexa Fluor 700eBioscience56-0032-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 605NCeBioscience93-0041-42
Tubo intramedicale in polietilene - PE20Becton Dickinson427406
BD Siringa da 1 mlBecton Dickinson309659
BD 26 G 3/8 Smusso intradermicoBecton Dickinson305110
Tampone RLT Lisi TamponeQiagen79216
Difco Triptico Soia AgarBecton Dickinson236950
Sangue di pecora defibrinatoPML MicrobiologicalsA0404
Kit RNAqueous-MicroAmbionAM1931
Trascrittasiinversa M-MuLVNew England BiolabsM0253L
GoTaq qPCR Master MixPromegaA6001

Riferimenti

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  1. Bogaert, D., de Groot, R., et al. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).
  2. Kadioglu, A., Weiser, J. N., et al. The role of Streptococcus pneumoni....

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Ristampe e permessi

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Streptococcus pneumoniaeIntranasal ColonizationNasopharyngeal ColonizationMouse ModelBacterial InoculumNasal LavageFlow CytometryQuantitative PCRSerial DilutionColony Forming Units

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