Metabolica Etichettatura di leucina Rich Repeat chinasi 1 e 2 con Radioactive fosfato

Jean-Marc Taymans; Fangye Gao; Veerle Baekelandt

doi:10.3791/50523

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Articolo metodologico

Metabolica Etichettatura di leucina Rich Repeat chinasi 1 e 2 con Radioactive fosfato

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DOI:

10.3791/50523

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18 settembre 2013

Jean-Marc Taymans¹ , Fangye Gao¹ , Veerle Baekelandt¹

¹Laboratory for Neurobiology and Gene Therapy, Department of Neurosciences, KU Leuven and Leuven Institute for Neuroscience and Disease (LIND)

In questo articolo

Sommario

Leucina ricca chinasi ripetizione 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) sono proteine multidominio che codificano sia GTPase e domini di chinasi e che sono fosforilata nelle cellule. Qui vi presentiamo un protocollo per etichettare LRRK1 e LRRK2 in cellule con ³² P ortofosfato, fornendo così un mezzo per misurare i loro livelli complessivi di fosforilazione cellulare.

Abstract

Leucina chinasi ricco ripetizione 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) sono paraloghi che condividono un dominio simile organizzazione, compreso un dominio chinasi serina-treonina, un complesso di Ras dominio proteine (ROC), un C-terminale del dominio ROC (COR), e ricco di leucina e ripetizioni ankyrin simile al N-terminale. I ruoli cellulari precise LRRK1 e LRRK2 devono ancora essere chiariti, tuttavia LRRK1 è stato implicato in tirosina chinasi recettore segnalazione ^1,2, mentre LRRK2 è implicato nella patogenesi della malattia di Parkinson ^3,4. In questa relazione, vi presentiamo un protocollo per etichettare le proteine LRRK1 e LRRK2 in cellule con ³² P ortofosfato, fornendo così un mezzo per misurare i livelli di fosforilazione complessivi di queste due proteine nelle cellule. In breve, l'affinità etichettato LRRK proteine sono espresse in cellule HEK293T che sono esposti al terreno contenente ³² P-ortofosfato. Il ³² P-ortofosfato viene assimilato dalle cellule dopo solo pochiore di incubazione e tutte le molecole nella cella contenente fosfati sono così marcato radioattivamente. Via il tag di affinità (3xflag) le proteine LRRK sono isolati dagli altri componenti cellulari mediante immunoprecipitazione. Gli immunoprecipitati sono quindi separati mediante SDS-PAGE, cancellati su membrane PVDF e analisi dei fosfati incorporate viene eseguita mediante autoradiografia ⁽³² segnale P) e rilevamento occidentale (segnale proteina) delle proteine sulle macchie. Il protocollo può essere facilmente adattato per monitorare la fosforilazione di qualsiasi altra proteina che può essere espresso in cellule e isolato mediante immunoprecipitazione.

Introduzione

Leucina ricca chinasi ripetizione 1 e 2 (LRRK1 e LRRK2) sono paraloghi multidominio che condividono un'organizzazione dominio simile. Entrambe le proteine codificano una sequenza GTPasi simile alla famiglia di GTPasi Ras (Ras di proteine complesse, o ROC), nonché un terminale C della ROC dominio (COR), classificando efficacemente entrambe le proteine della famiglia di proteine ROCO ^5,6. N-terminale del dominio tandem ROC-COR, entrambe le proteine codificare un dominio ripetizione ricca di leucina e un dominio ankyrin simile, mentre solo LRRK2 codifica un armadillo supplementare domein ^6-8. C-terminale della ROC-COR, entrambe le pro....