Vivere Imaging test per la valutazione dei ruoli di Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; E sfingomielinasi nella riparazione di Pore-formano ferite Tossina

Sommario

Vivo imaging di cellule esposte al colorante lipofilo FM1-43 consente una determinazione precisa della cinetica con cui tossine formanti pori vengono rimossi dalla membrana plasmatica. Questo è un test sensibile che può essere utilizzato per valutare requisiti di Ca ^{2 +,} sfingomielinasi e altri fattori sulla membrana plasmatica di riparazione.

Abstract

Lesione della membrana plasmatica è un evento frequente, e le ferite devono essere rapidamente riparato per garantire la sopravvivenza cellulare. Afflusso di Ca ^{2 +} è un evento chiave di segnalazione che attiva la riparazione di ferite meccaniche sulla membrana plasmatica entro ~ 30 sec. Recenti studi hanno rivelato che le cellule di mammifero anche richiudersi loro membrana plasmatica dopo permeabilizzazione con formazione di pori tossine in un processo ^{2 +-dipendente} Ca che coinvolge esocitosi della sfingomielinasi acida lisosomiale seguita da pori endocitosi. Qui, descriviamo la metodologia utilizzata per dimostrare che la richiusura delle cellule permeabilizzate dalla tossina streptolisina O è anche un rapido e dipendente da Ca ^{2 +} afflusso. Il design saggio permette la sincronizzazione dell'evento lesioni e una misurazione cinetica precisa della capacità delle cellule di ripristinare l'integrità della membrana plasmatica mediante imaging e quantificare la misura in cui il colorante liphophilic FM1-43 raggiunge membrane intracellulari. Questo live als testO consente una valutazione sensibile della capacità di esogenamente aggiunto fattori solubili quali sphingomyelinase inibire FM1-43 afflusso, riflettendo la capacità delle cellule di riparazione sulla membrana plasmatica. Questa analisi ha permesso di mostrare per la prima volta che sphingomyelinase agisce a valle di Ca ^{2 +-dipendente} esocitosi, poiché extracellulare aggiunta dell'enzima promuove richiusura delle cellule permeabilizzate in assenza di Ca ^{2 +.}

Introduzione

E 'noto da diversi decenni riparazione della membrana plasmatica dopo una lesione meccanica è un ^1,2 Ca ^{2 +-dipendente} processo. Studi successivi hanno mostrato che Ca ^{2 +} afflusso attraverso la ferita innesca un vigoroso processo di esocitosi di vescicole intracellulari al sito della lesione, che è richiesto per richiusura ^3,4. Il tasso di perdita di un colorante fluorescente caricato nel citoplasma delle cellule è stato utilizzato per valutare la velocità di riparazione, concludendo che richiusura è stato completato entro <30 sec dopo la lesione ^5. Due modelli sono stati inizialmente proposti per spiegare il requisito di esocitosi nella riparazione membrana plasmatica: 1) il modello "patch", che suggerisce che Ca ^{2 +} afflusso attraverso la lesione innesca fusione inizialmente omotipica di vescicole intracellulari, formando una grande "patch" che sarebbe poi essere applicato alla membrana plasmatica di richiudere la ferita ⁶ e 2) il modello di riduzione della tensione, che propone di membrana Added entro Ca ^{2 +-dipendente} esocitosi in prossimità della ferita ridurrebbe tensione della membrana plasmatica, facilitando richiusura del doppio strato ^7. Il ruolo di Ca ^{2 +-triggered} esocitosi nel plasma di riparazione della membrana è stata ulteriormente rafforzata da studi che dimostrano che i lisosomi contengono una molecola di Ca ^{2 +} sensore, synaptotagmin VII, che facilita il loro esocitosi e plasma riparazione della membrana in cellule danneggiate ^8,9,10,11 .

Tuttavia, ulteriori elementi di prova ha indicato che solo esocitosi non era sufficiente a promuovere la riparazione della membrana plasmatica. Oltre alle rotture meccaniche sulla membrana plasmatica, una forma frequente di danno cellulare è permeabilizzazione da tossine formanti pori prodotte da batteri o cellule immunitarie ^{12,13 14,15.} Diversamente lacrime meccanici, proteine ​​formanti pori si inseriscono sulla membrana plasmatica formando una stabile, poro proteina-allineato che non può essere richiuso semplicemente applicando una "patch" membrana o da riduzioneing tensione della membrana. Curiosamente, studi hanno rivelato che le cellule di mammifero hanno un meccanismo efficace per riparare la membrana plasmatica dopo permeabilizzazione con proteine ​​formanti pori, e questo processo richiede anche la presenza di Ca ^{2 +} extracellulare ^12. Questa scoperta ha sollevato la questione se la rimozione dei pori transmembrana dalla superficie cellulare era anche un processo rapido, come osservato con ferite meccaniche ^5. Sorprendentemente, i nostri studi recenti rivelato che la richiusura delle cellule permeabilizzate con tossine formanti pori ha proprietà molto simili alla riparazione di ferite meccaniche: il processo richiede Ca ^{2 +} extracellulare, e completata entro ~ 30 sec. Indagare questo processo più in dettaglio, abbiamo recentemente appreso che, oltre a Ca ^{2 +} esocitosi regolata dei lisosomi, riparazione membrana plasmatica comporta una rapida forma di endocitosi, che viene attivato dal rilascio dell'enzima lisosomiale sfingomielinasi acida (ASM) ed è essenziale non solo per the rimozione dei pori transmembrana, ma anche per la riparazione di ferite meccaniche ^16.

Per determinare la cinetica di una nuova chiusura cellule dopo permeabilizzazione con le proteine ​​formanti pori, nel nostro laboratorio abbiamo adattato una metodologia di imaging dal vivo che era stato precedentemente utilizzato per valutare la richiusura delle fibre muscolari isolate infortunato laser ^17. Questo test si basa sulle proprietà del colorante lipofilo FM1-43, che si intercala stabilmente nel foglietto esterno di bistrati lipidici crescente di intensità di fluorescenza. Quando la membrana a doppio strato plasma viene perturbato extracellulari guadagni tinture accesso alle membrane intracellulari, fornendo un saggio sensibile per rilevare lesioni membrana plasmatica e riparare ^18,16,19,20. Per adattare questo test per la valutazione della richiusura cellule dopo permeabilizzazione con le proteine ​​formanti pori, abbiamo le cellule pre-incubate a 4 ° C con la tossina batterica streptolisina O (SLO), che si lega al colesterolo di membrana ^21. Cell sincronopermeabilizzazione può quindi essere facilmente ottenuto spostando le celle da ghiaccio per riscaldare medie in una fase microscopio riscaldata, che attiva l'oligomerizzazione e cambio di conformazione che porta alla formazione di pori transmembrana. Un vantaggio di questo approccio, nei saggi precedentemente pubblicati utilizzando ferimento laser, è che un numero maggiore di cellule possono essere analizzati simultaneamente in un campo microscopico, fornendo una migliore campionamento della popolazione cellulare. Date le similarità meccanicistiche tra il processo richiusura cellulare visto dopo l'infortunio meccanica e permeabilizzazione con le tossine che formano pori, il saggio che descriviamo qui fornisce un metodo molto versatile e potente per i fattori coinvolti nel fondamentale processo di riparazione della membrana plasmatica dissezione. Come esempio, si dimostra che è possibile utilizzare questo test per identificare fasi Ca ^{2 +} dipendenti ed indipendenti del processo di riparazione.

Protocollo

1. Trascrizionale silenziamento di ASM

1. Seme 1,5 x 10 ⁵ cellule HeLa in 2 ml di DMEM mezzi di crescita (alto glucosio DMEM con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutammina, 1% Penn-Strep) su piastre inferiori 35 millimetri di vetro (MatTek) e incubare una notte a 37 ° C in un incubatore CO ₂ 5%.
2. Il giorno seguente, aspirato fuori i terreni di crescita e sostituirlo con 2 ml di DMEM ridotta mezzo siero (DMEM con 4% FBS), almeno 1 ora prima di aggiungere la miscela di trasfezione siRNA.
3. Preparare 4 tubi per la miscela di oligo trasfezione di siRNA. In provette A e C, aggiungere 250 microlitri OptiMEM ridotta siero e 4 microlitri Lipofectamine RNAiMax, per 35 millimetri piatto da transfettate. In tubo B, aggiungere 250 ml di OptiMEM ridotti siero e 8 microlitri (160 pmoli), del controllo del contenuto GC medio oligo (Control siRNA), per 35 millimetri piatto da transfettate. In tubo D, aggiungere 250 ml di OptiMEM ridotti siero e 8 microlitri (160 pmoli) di SMPD1 oligo (smo), per 35 millimetri piatto to essere transfettate. Incubare le provette a temperatura ambiente per 5 min.
4. Unire i tubi A e B per formare il complesso trasfezione per il controllo siRNA e tubi C e D per la ASM siRNA. Incubare le reazioni a temperatura ambiente per 20 min.
5. Aggiungere miscele di reazione trasfezione controllo siRNA e ASM siRNA lentamente, goccia a goccia, nei rispettivi piatti peggiori 35 mm vetro e incubare a 37 ° C / 5% di CO _2. A 24 ore dopo la trasfezione, delicatamente aspirare fuori dei media e sostituirlo con fresco terreni di coltura DMEM. Per efficiente knockdown ASM, i piatti dovrebbero essere ulteriormente incubate a 37 ° C / 5% di CO ₂ per circa 31 ore (totale 55 ore) prima di imaging in tempo reale.

2. Preparazione dei reagenti per Live Microscopia

1. Preparare una soluzione di formazione di pori ricombinante tossina Streptolisina O (SLO) ad una concentrazione di 100 ng / ml in PBS 1x freddo senza Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +.} La SLO utilizzata in questi test è un constitutively mutante cisteina attivo che non richiede agenti riducenti per l'attività, gentilmente fornito dal Dr. Rod Tweten, University of Oklahoma. La tossina è stata espressa in E. coli BL21 DE3 e purificata in condizioni native, come descritto in precedenza ^16.
2. Preparare la soluzione stock FM1-43: Risospendere FM1-43 polvere liofilizzata in DMSO per creare una soluzione di 25 mm.
3. Preparare Soluzione A: Diluire la soluzione stock FM1-43 in DMEM fredda con Ca ^{2 +} ad una concentrazione finale di 4 micron (1,5 ml sono necessari per ogni piatto MatTek) e memorizzare sul ghiaccio fino al momento dell'uso.
4. Preparare Soluzione B: Diluire la soluzione stock FM1-43 in DMEM freddo senza Ca EGTA mM ^{2 +} e 10 (Ca ^{2 +} DMEM-free) ad una concentrazione finale di 4 micron (1,5 ml necessari per ogni piatto MatTek) e memorizzare sul ghiaccio fino necessario.
5. Pre-caldo (37 ° C) 1 ml della soluzione A e soluzione B in provette Eppendorf.
6. Continuate a soluzioni di ghiaccio di DMEM con Ca ^{2 +} e Cun DMEM ^{2-free +.}

3. Imaging cellulare dal vivo di FM1-43 Afflusso in SLO trattati e cellule non trattate

1. Riempire un contenitore metallico superficiale medie dimensioni con ghiaccio tritato, invertire in un grande contenitore di vetro con ghiaccio, e aggiungere ulteriori ghiaccio lasciando solo la superficie di fondo del contenitore metallico esposto. Mettere un tovagliolo di carta bagnato sul fondo metallico esposto per consentire il trasferimento anche termico.
2. Prendete un piatto MatTek controllo siRNA-trattati (campione 1) e posizionarlo sul freddo umido tovagliolo di carta. Aspirare delicatamente tutti i media e lavare 3 volte con il freddo Ca ^{2 +} senza DMEM. Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare via tutti i supporti nel piatto.
3. Per immagine associata alle cellule FM1-43 in cellule senza SLO ferimento (Esempio 1) in presenza di Ca ^{2 +,} aggiungere 180 ml ​​di soluzione fredda B al vetro coprioggetto centro del piatto inferiore 35 mm vetro e incubare per 5 min in ghiaccio (Tabella 1).
4. Posizionare piatto MatTek sulla scena di un microscopio confocale riscaldato a 37 ° C e dotato di una camera climatica (che mantiene la temperatura, l'umidità e CO ₂ livelli). Trovare il campo di celle che verrà creata l'immagine guardando attraverso un 40X NA 1.3 obiettivo (Nikon). Se disponibile, attivare PerfectFocus o un dispositivo simile per correggere la deriva termica.
5. Aggiungere 1 ml di soluzione A preriscaldata delicatamente al lato del piatto 35 mm e rimettere il coperchio della camera ambientale (Tabella 1).
6. Acquisire immagini per 4 min a 1 fotogramma ogni 3 secondi utilizzando il software di imaging appropriato (Volocity del sistema di filatura di microscopia confocale disco UltraView Vox Perkin Elmer). Eccitazione FM1-43 è realizzato con una linea laser 488 nm usando un filtro dicroico con un passa banda 488 nm, e la discriminazione di emissione è ottenuta attraverso l'uso di un filtro 527 (W55) emissione. Livelli di potenza del laser e la sensibilità della fotocamera sono impostate per ottenere esposizioni di immagine di 100 msec.
7. Ripetere i punti da 3.2 a 3.6 per rilevare FM1-43 in cellule siRNA-trattate controllo senza ferita SLO (Esempio 2) in assenza di Ca ^{2 +,} salvo che al punto 3.5 Soluzione B dovrebbe essere aggiunto (Tabella 1).
8. Per misurare FM1-43 afferisce nelle cellule di controllo siRNA-trattati con feriti SLO sia in presenza (Esempio 3) o assenza di Ca ^{2 +} (Esempio 4), aggiungere 180 ml ​​di soluzione fredda B contenenti SLO al vetro coprioggetto centro 35-mm piatto fondo di vetro e incubare per 5 minuti sul ghiaccio come nella fase 3.3. Ripetere i passi 3.2 tramite 3.6; regolare l'aggiunta di uno o Soluzione A Soluzione B nella fase 3.5 (Tabella 1).
9. Per determinare il ruolo di ASM nel plasma di riparazione della membrana, ripetere i passaggi 3,2-3,6 utilizzando cellule trattate con siRNA ASM per tutte le condizioni (campioni 5-8) (Tabella 1).
10. Per determinare il ruolo di sfingomielinasi extracellulare ricombinante (SM) sulcinetica di riparazione della membrana plasmatica (riflessi dalla inibizione in FM1-43 afflusso) (Campioni 9-10), SM viene aggiunto (0-50 μU) a uno o Soluzione A Soluzione B al punto 3.5 e quindi aggiunti alle cellule durante cellule vive rappresentazione in un volume totale di 1 ml (Tabella 1).

4. Quantificazione dei FM1-43 Afflusso in cellule

1. Dopo il film sono stati acquisiti, misurare l'intensità di fluorescenza intracellulare di FM1-43 utilizzando il software di analisi di immagine (Volocity Suite, PerkinElmer). Prelievo di una regione di interesse nella regione citosolica di ciascuna cella nel campo e applicare gli strumenti software per determinare la media FM1-43 intensità di fluorescenza in tutte le strutture del video.
2. Per regolare le variazioni di iniziale FM1-43 colorazione, i dati per ciascun video vengono espressi come fold aumento di intensità di fluorescenza nel tempo, e tracciate per ciascuna delle diverse condizioni. L'aumento piega in fluorescenza di ciascun tempo di valutazione percella viene calcolato come F _T / F _0, dove F _T è la fluorescenza media al timepoint specifico, e F ₀ è la fluorescenza media a T = 0 (figure 1-2).

Risultati

Basse concentrazioni di batteri plasma sphingomyelinase (SM) salvataggio riparazione della membrana delle cellule impoverito in acido lisosomiale sphingomyelinase.

Usando il test di imaging FM1-43, abbiamo precedentemente dimostrato che cellule carenti per la ASM lisosomiale ed esposte a SLO ferendo in presenza di Ca ^{2 +} hanno una membrana plasmatica difetto viene salvato da extracellulare aggiunta dell'enzima umano ricombinante ^19. Poiché la ASM lisosomiale umano ha u...

Discussione

Studi precedenti sul pregiudizio e la membrana plasmatica riparazione meccanica invocati diversi meccanismi delle cellule feriti, che vanno dalla caduta perle di vetro, micropipetting, tranciatura, graffiare o raschiare. La lettura di tutti questi saggi era più qualitativa che quantitativa, e non dare informazioni precise sulla cinetica del meccanismo di riparazione. La capacità delle cellule di richiudere loro membrana plasmatica dopo queste forme di lesioni è stata misurata dalla presenza o assenza di rivelatori aggiu...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagent
HeLa 229 linea cellulare	ATCC	CCL2-1
DMEM High Glucose	Invitrogen	11965
DMEM High Glucose No Calcium	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem Reduced Serum	Invitrogen	31985
Lipofectamina RNAiMax	Invitrogen	13778
Mezzo di controllo Contenuto GC RNAi oligo	Invitrogen	12935300
SMPD1 RNAi oligo	Invitrogen	HSS143988
Siero fetale bovino Inattivato termicamente	Gemini-Bioproducts	100-106
Sfingomielinasi da Bacillus cereus	Sigma	S7651
Piastre inferiori in vetro da 35 mm	MatTek	P35G-0-14
Material
Fliped Microscopio invertito	Nikon	Eclipse Ti
Camera	Hamamatsu Photonics	C9100-50
Microscopio confocale a disco rotante	PerkinElmer	UltraViewVoX
Analisi del software software	PerkinElmer	Volocity Suite
Camera climatica	Dispositivi di patologia	LiveCell System Camera