Trapianto di progenitori miogenici pluripotenti derivati da cellule staminali indotte simili a mesoangioblasti nei modelli di topo di rigenerazione muscolare

Sommario

I progenitori miogenici derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono promettenti candidati per le strategie di terapia cellulare per il trattamento delle distrofie muscolari. Questo protocollo descrive i trapianti e le misurazioni funzionali necessarie per valutare l'innesto e la differenziazione dei mesoangioblasti derivati dall'iPSC (un tipo di progenitori muscolari) nei modelli di topo di rigenerazione muscolare acuta e cronica.

Abstract

Gli iPSC derivati dal paziente potrebbero essere una fonte inestimabile di cellule per i futuri protocolli di terapia cellulare autologa. Le cellule staminali/progenitrici miogeniche derivate da iPSC simili ai mesoangioblasti derivati dai periciti (cellule staminali/progenitrici simili a mesoangioblasti derivate da iPSC: IDEM) possono essere stabilite da iPSC generati da pazienti affetti da diverse forme di distrofia muscolare. Gli IDEM specifici del paziente possono essere corretti geneticamente con diversestrategie (ad esempio vettori lentivirali, cromosomi artificiali umani) e potenziati nel loro potenziale di differenziazione miogenica dopo l'iperespressione del regolatore di miogenesi MyoD. Questo potenziale miogenico viene quindi valutato in vitro con specifici saggi di differenziazione e analizzato per immunofluorescenza. Il potenziale rigenerativo degli IDEM viene ulteriormente valutato in vivo, su trapiantointramuscolare e intra-arterioso in due modelli rappresentativi di topo che mostrano rigenerazione muscolare acuta e cronica. Il contributo degli IDEM al muscolo scheletrico ospite è quindi confermato da diversi test funzionali nei topi trapiantati. In particolare, il miglioramento della capacità motoria degli animali viene studiato con prove sul tapis roulant. L'innesto e la differenziazione cellulare vengono quindi valutati da una serie di test istologici e immunofluorescenza sui muscoli trapiantati. Nel complesso, questo documento descrive i saggi e gli strumenti attualmente utilizzati per valutare la capacità di differenziazione degli IDEM, concentrandosi sui metodi di trapianto e sulle successive misure di risultato per analizzare l'efficacia del trapianto cellulare.

Introduzione

I mesoangioblasti (MAB) sono progenitori muscolari associati ai vasi derivati da un sottoinsieme di periciti^1-3. Il principale vantaggio dei MAB rispetto ai progenitori muscolari canonici come le cellule satellitari⁴ risiede nella loro capacità di attraversare la parete del vaso quando vengono consegnati intra-arteriosamente e quindi contribuire alla rigenerazione muscolare scheletrica nei protocolli di terapia cellulare. Questa caratteristica è stata valutata e confermata sia nei modelli murini che canini di distrofia^{muscolare 1,5,6}. Questi studi preclinici hanno gettato le basi per uno studio clinico di fase I/II del primo uomo basat....

Protocollo

1. Valutazione del potenziale miogenico e di innesto

1. In vitro:differenziazione indotta da MyoD
   1. Generare una linea cellulare stabile di IDEM trasdotti con il vettore lentivirale MyoD-ER inducibile al tamoxifene, che titra la molteplicità dell'infezione (MOI; ad esempio 1, 5 e 50) utilizzando la colorazione descritta al punto 1.1.9 (MyHC) come risultato dell'efficienza della procedura.
   2. Ricoprire un piatto da 3,5 cm con 1 ml di 1% di Matrigel e incubare per 30 min a 37 °C.
   3. Lavare il piatto due volte con iDEM trasdotti medium, seme 1 x^{10 5} MyoD-ER nel piatto di coltura tissutale da 3,5 cm e incubare a 3....

Risultati

I risultati rappresentativi riportati seguono i principali saggi in vitro/in vivo descritti nel flusso di lavoro nella figura 1. 48 ore dopo la somministrazione di 4OH-tamoxifene I nuclei mioD-positivi sono identificabili all'interno degli IDEM trasdotti MyoD-ER incoltura (Figura 2A). Le celle si fondono e si differenziano quindi in miotubi multinucleati (Figura 2B). Se trapiantati per via intramuscolare in un modello murino di lesione muscolare acuta, gli IDEM .......

Discussione

Gli iPSC possono essere espansi indefinitamente preservando il loro potenziale di auto-rinnovamento e quindi essere diretti a differenziarsi in un'ampia gamma di lignaggi^{cellulari 12}. Per questo e altri motivi le cellule staminali/progenitrici derivate da iPSC sono considerate una fonte promettente per gli approcci autologi di terapia genica e cellulare¹³. Un lavoro pubblicato in precedenza dagli Autori ha riportato la generazione di progenitori miogenici di topi e umani da iPSC con un fenotipo simi.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
REAGENTS
MegaCell DMEM	Sigma	M3942
DMEM	Sigma	D5671
IMDM	Sigma	I3390
Siero di cavallo	Euroclone	ECS0090L
Siero Bovino Fetale	Lonza	DE14801F
Lonza	BE17-516F		senza Calcio/Magnesio
L-Glutammina	Sigma	G7513
Penicillina/Streptomicina	Sigma	P0781
2-Mercaptoetanolo	Gibco	31350-010
ITS (insulina-transferrina-selenio)	Gibco	51500-056
Soluzione di aminoacidi non essenziali	Sigma	M7145
Fer-In-Sol	Mead Johnson
Ferlixit	Aventis
Acido oleico	Sigma	01257-10 mg
Acido Linoleico	Sigma	L5900-10 mg
Umano bFGF	Gibco	AA 10-155
Fattori di crescita ridotti Matrigel	Becton Dickinson	356230
Tripsina	Sigma	T3924
Eparina di sodio	Mayne Pharma
Soluzione blu di tripano	Sigma	T8154	DANNOSO
Colorante blu brevettato	Sigma	19, 821-8
EDTA	Sigma	E-4884
Paraformaldeide	TAAB	P001	DANNOSO
Tamoxifene	Sigma	T5648
4-OH Tamoxifene	Sigma	H7904
pLv-CMV-MyoD-ER(T)	Addgene	26809
Cardiotossina	Sigma	C9759	DANNOSO
Iodio
Gomma Tragachant	MP Biomedicals	104792
isopentano	VWR	24.872.323
Tissue-tek OCT	Sakura	4583
Saccarosio	VWR	27.480.294
Vetrini polarizzati	Thermo	J1800AMNZ
Eosin Y Sigma		E4382
Ematossilina	Sigma	HHS32
Tricromia di Masson	Bio-Optica	04-010802
Topo anti miosina anticorpo a catena pesante	DSHB	MF20
Anticorpo anti-lamina A/C di topo	Novocastra	NLC-LAM-A/C
Hoechst 33342	Sigma Fluka	B2261
Coniglio anti anticorpo laminina	Sigma	L9393
MATERIALI E ATTREZZATURE
Sutura antibatterica adsorbibile 4-0	Ethicon	vcp310h
Siringa ad ago da 30 G	BD	324826
Tapis roulant			Columbus
Steromicroscopio	Nikon	SMZ800
Microscopio invertito	Leica	DMIL LED
Unità di isoflurano		Harvad
Fibra ottica	Euromecs (Olanda)	EK1
Termoforo	Vet Tech	C17A1
Bisturi	Swann-Morton	11REF050
Pinze chirurgiche	Fine Scientific Tools		5/45
Cauterizzatore ad alta temperatura	Bovie Medical	AA01
COMPOSIZIONE DEI MEDIA
La composizione dei media è descritta di seguito. Terreno di crescita HIDIM: MegaCell Dulbecco's Modified Eagle Medium (MegaCell DMEM) 5% siero fetale bovino (FBS) 2 mM glutammina 0,1 mM β-mercaptoetanolo 1% aminoacidi non essenziali 5 ng/ml di fattore di crescita dei fibroblasti basici umani (bFGF) 100 UI ml di penicillina 100 mg/ml di streptomicina In alternativa, se alcuni dei reagenti di cui sopra non sono disponibili, gli HIDEM possono essere coltivati in: Terreno di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM) 10% FBS 2 mM glutammina 0,1 mM β-mercaptoetanolo 1% aminoacidi non essenziali (NEAA) 1% ITS (insulina/transferrina/selenio) 5 ng/ml umano bFGF 100 UI ml penicillina 100 mg/ml streptomicina 0,5 μ Acidi coleico e linoleico 1,5 μ M Fe2+ (Fer-In-Sol) 0.12 μ M Fe3+ (Ferlixit) Mezzo di crescita MIDEMs: DMEM 20% FBS 2 mM glutammina 5 ng/ml umano bFGF 100 UI ml penicillina 100 mg/ml streptomicina Mezzo di differenziazione: DMEM 2% Siero di cavallo (HS) 100 UI ml penicillina 100 mg/ml streptomicina 2 mM glutammina
Tabella 1. Elenco dei reagenti, dei materiali, delle attrezzature e dei mezzi.

PBS povidone Strumento Apparato