One Minute, Sub-One-Watt Photothermal ablazione del tumore Utilizzando Porphysomes, intrinseca multifunzionale nanovesicles

Sommario

Abbiamo sviluppato nuovi nanovesicles multifunzionali intrinseche chiamati porphysomes, che hanno struttura-dipendente fluorescenza auto-estinzione e le proprietà fototermiche uniche, fungendo così gli agenti di terapia fototermica come potenti. Abbiamo formulato porphysomes utilizzando estrusione ad alta pressione e studiato l'efficacia della terapia photothermal in un modello di tumore xenotrapianto.

Abstract

Abbiamo recentemente sviluppato porphysomes come nanovesicles intrinsecamente multifunzionali. Un fotosensibilizzante, pyropheophorbide α, è stato coniugato ad un fosfolipide e quindi auto-assemblato vescicole sferiche liposoma-like. A causa della densità estremamente elevata della porfirina nel doppio strato lipidico porfirina, porphysomes generato grandi coefficienti di estinzione, la struttura dipendente dalla fluorescenza di auto-spegnimento, e ottima efficacia fototermica. Nella nostra formulazione, porphysomes stati sintetizzati utilizzando estrusione ad alta pressione, e visualizzate una dimensione media delle particelle di circa 120 nm. Iniezione Ventiquattro ore dopo endovenosa di porphysomes, la temperatura locale del tumore è aumentata da 30 ° C a 62 ° C rapidamente su uno minuti di esposizione di 750 mW (1,18 W / cm ^2), 671 nm laser irradiazione. Seguendo l'ablazione termica completa del tumore, escare formata e guarito entro 2 settimane, mentre nei gruppi di controllo i tumori hanno continuato a crescere e tutti raggiunto il en definitalettera d entro 3 settimane. Questi dati mostrano come porphysomes possono essere usate come terapia photothermal potente (PTT) agenzie.

Introduzione

Porphysomes sono nanovesicles nuovi multifunzionali che abbiamo recentemente sviluppato, che sono in grado di imaging e terapia multimodale ^1. Esse sono formate da doppi strati porfirinici auto-assemblati e contengono una altissima densità di porfirina (oltre 83, 000/porphysome particella), che genera grande coefficiente di estinzione e risultati in unica struttura-dipendente fluorescenza auto-spegnimento. Porphysomes hanno buone in vivo farmacocinetica e biodistribuzione proprietà: essi mostrano un sangue emivita di 12 ore dopo la somministrazione sistematica, e passivamente accumulano nei tumori trapiantati con 7,5% ID / g in 24 ore dopo l'iniezione ^2.

La loro struttura unica e le proprietà fisico-chimiche fanno porphysome un buon candidato per l'imaging multimodale e la terapia immagine-guida. Prima di tutto, contenente porfirina, porphysomes sono intrinsecamente adatti per imaging di fluorescenza dei tumori sulla accumulo tumore ^1.Inoltre, ogni porfirina ha un sito stabile per radioisotopi chelanti, dunque, porphysomes possono essere facilmente etichettati con radioisotopi come 64Cu per l'imaging PET ^3. Inoltre, l'energia luminosa assorbita viene dissipata termicamente sotto irraggiamento laser di esposizione quando porphysome struttura è intatta, così porphysomes mostrano anche immagini fotoacustica unico e funzionalità PTT. E 'stato dimostrato che 24 ore dopo l'iniezione endovenosa di porphysomes, irradiazione laser del tumore porphysome accumulata ha indotto un aumento di temperatura rapido e forte fototermico ablazione del tumore. Ciò ha dimostrato che porphysomes sono stimolatori fototermiche efficienti con coefficiente di estinzione alto come le nanoparticelle d'oro (AuNPs) ^1. D'altra parte, in confronto con altri agenti fototermiche inorganici, incluse AuNPs, porphysomes mostrano un vantaggio eccezionale nei biosicurezza a causa della loro natura organica. Porphysomes sono enzimaticamente biodegradabili e inducono minimo toxicit acutay in topi con dosi endovenose alto come 1,000 mg / kg ^1. Inoltre, simile a liposomi, il grande nucleo acquosa di porphysomes potrebbe essere passivamente o attivamente caricato con agenti terapeutici o di imaging. Le proprietà ottiche e biocompatibilità di porphysomes dimostrano il potenziale multimodale di nanoparticelle organiche per l'imaging e la terapia BioPhotonic.

In questo lavoro, si introduce il metodo di sintesi di coniugati pyropheophorbide-lipidico, la fabbricazione e il metodo di caratterizzazione di porphysomes utilizzando estrusione ad alta pressione. PTT in vivo su topi è condotta anche per dimostrare l'efficienza di porphysome abilitati PTT nel tumore trattamento con un modello di tumore xenotrapianto sottocutanea.

Protocollo

1. Sintesi di Pyropheophorbide lipidi

1. Unire 200 mmol pyropheophorbide (preparato da Spirulina Pacifica alghe come descritto in precedenza,... Zheng et al, Bioconj Chem, 2002, 13 -392) ^4, 98,7 mg 16:00 lysophophatidylcholine (1-palmitoil-2-idrossi-sn-glycero -3-fosfocolina, Avanti Polar Lipidi # 855675), 76,3 mg di EDC, 48,7 mg DMAP (4 - (dimetilammino) piridina) in 5 ml amylene stabilizzato cloroformio per un rapporto di 1:1:2:2 Pyro: Lipid: EDC : DMPA.
2. Mescolare la miscela di reazione a temperatura ambiente sotto argon per 24 h. Si evapora il cloroformio sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante con riscaldamento a 40 ° C. La miscela di isomeri piro-lipidico (pyro attaccati alla posizione sn-1 e sn-2) viene prodotto.
3. Risospendere piro-lipidico miscela di isomeri in 1 mM CaCl _2, Tris 50 mM (pH 8), 0,5% Triton X-100 e 10% di metanolo alla concentrazione di 5 mg / ml. Aggiungi fosfolipasi A2 (PLA2), dal miele al veleno d'api0,1 mg concentrazione ml / e incubare la soluzione a 37 ° C per 24 ore per digerire sn-1 piro-lipidico e per produrre il puro sn-2 piro-lipidico isomero.
4. Aggiungere ulteriori 2 volumi di cloroformio e di 1,25 volumi di metanolo, estratto, e quindi rimuovere il solvente con evaporatore rotante a pressione ridotta a 40 ° C. Risospendere il prodotto di scissione in 1% MeOH in DCM e purificare su una piccola colonna di silice diolo per la isomericamente puro piro-lipidico.

2. Preparazione di Porphysomes

1. Sciogliere pyropheophorbide-lipide, distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-metossi (polietilene glicole) (PEG-2000-PE) e colesterolo in cloroformio separatamente, e registrare le concentrazioni rispettivamente.
2. Preparare porphysome film lipidico in una provetta 12x75 mm prova borosilicato con un peso lipidico totale di 5 mg / tubo combinando il 65% molare porfirina-lipide, 5% molare PEG-2000-PE e il 30% molare colesterolo.
3. Asciugare i film lipidici sotto un getto di nitrogas gen e farli ulteriormente essiccati sotto vuoto per 1 ora. Memorizzare i film lipidici a -20 ° C sotto argon fino futuro idratazione ed estrusione.
4. Aggiungere 1 ml di tampone fosfato salino (PBS, 150 mM NaCl, 10 mM fosfato, pH 7.4) a ciascuna provetta film lipidico. Congelare la provetta in azoto liquido fino a completo congelato, e poi scongelare il tubo 65 ° C bagnomaria finché il campione è tutto sciolto. Vortex il tubo per un totale di 30 sec (3x a 10 sec ciascuno, con 5 sec ri-riscaldamento a 65 ° C in bagno d'acqua tra ogni vortex).
5. Ripetere il congelamento-scongelamento per 5 cicli o più al momento necessaria fino a quando non grandi aggregati possono essere osservati nella soluzione idratata. Lasciare la sospensione porphysome sul ghiaccio quando fatto.
6. Montare l'estrusore ad alta pressione (10 ml) con due filtri in policarbonato 100 nm accatastati installati dentro Collegare l'estrusore thermobarrel ad un circolatore termostatato a 65 ° C in circolazione bagnomaria, e collegare il sistema estrusore ad un serbatoio di azoto per alta pressionesicuro approvvigionamento.
7. Trasferire la sospensione porphysome alla camera estrusore con una pipetta di trasferimento vetro 9 pollici. Impostare la pressione ruotando la manopola sul regolatore serbatoio di azoto fino a una lettura tra 200 e 300 psig è osservato come pressione di estrusione iniziale. Aprire la valvola del regolatore di pressione gradualmente fino portata porphysome sufficiente è raggiunto o viene raggiunto un massimo di 800 psig (5.440 kPa) di pressione.
8. Dopo il primo passaggio di estrusione, chiudere la valvola di controllo della pressione e rilasciare la pressione dell'estrusore aprendo la valvola limitatrice della pressione sulla parte superiore estrusore. Riempire il estrusore con la soluzione porphysome appena estruso, e ripetere l'estrusione per almeno 10 volte per assicurare la soluzione estruso finale è omogeneo.
9. Determinare la concentrazione della soluzione finale porphysome misurando l'assorbimento di un campione diluito in metanolo per UV-Vis spettrometro. Calcolare la concentrazione utilizzando la seguente equazione with il coefficiente di estinzione di 97.000 M ^-1 cm ^-1 a 410 nm per pyropheophorbide-lipidico.

10. Misurare la distribuzione finale dimensioni di porphysomes utilizzando un Malvern Zetasizer ZS90 dalla dispersione della luce dinamica. Diluire la soluzione porphysome in PBS e di eseguire tre misurazioni con 15 corse ciascuno per i risultati medi.
11. Determinare il quenching di fluorescenza porphysome confrontando l'emissione di fluorescenza di porphysome temprato (1 mM in PBS) e porphysome unquenched (1 mM in 1% Triton X-100) utilizzando Spectrofluorometer. Prendere gli spettri prima e dopo il detersivo (Tirton X-100) si aggiunge, e normalizzare il segnale di lettura massima fluorescenza. Impostare l'eccitazione di essere 410 nm, e l'emissione gamma di lunghezze d'onda per essere 600-800 nm.
12. Tenere soluzione porphysomes sotto argon a 4 ° C fino all'utilizzo futuro, e proteggerlo dalla luce in alluminio folio.

3. Preparazione di Animal Xenograft Modello

1. Cultura le cellule KB in RPMI-1640 (con 10% FBS), e sostenere le cellule in 5% di CO ₂ e l'atmosfera idratata a 37 ° C.
2. Cellule Harvest KB utilizzano tecniche di coltura cellulare standard. Mantenere la sospensione cellulare (20.000 cellule / ml) in tampone fosfato (PBS) in ghiaccio per la conservazione a breve termine fino al momento dell'iniezione.
3. Preparare un KB xenotrapianti in topi nudi. Topi nudi sono acquistati da Charles River Laboratories quando sono di 20 g (Categoria # Crl: NU (NCR)-Foxn1 ^nu, 6-7 settimane di età), data dieta standard e biancheria da letto (Harlan Laboratories, Dieta: irradiato LM-485, # 7912; Letti: biancheria da letto Pannocchia, ¼ ", # 7097). Sterilizzare tutti gli strumenti di gestione degli animali (siringhe, pinze e pastiglie animale) prima di esperimenti. Anestetizzare topi con 2% isoflurano v / v in 100% di ossigeno gassoso. Tutti i protocolli animali sono approvati dall'istituzione (University Health NeTwork in questo caso) la cura degli animali e l'uso commissione.
4. Iniettare cellule tumorali sospese in PBS per via sottocutanea al fianco destro del mouse. I topi sono pronti per essere utilizzati dopo 10 giorni quando tumore raggiunge diametro di 4-5 mm e spessore di 2-3 mm.

4. In vivo Photothermal Therapy

1. Iniettare porphysomes (contenenti 750 nmol pyro al volume di 200 ml) per via endovenosa via vena della coda. Condurre laser irradiazione 24 ore dopo l'iniezione di porphysomes.
2. In questa sezione, eseguire tutte le procedure in una camera di sicurezza laser chiusa. Indossare occhiali di protezione laser durante l'irraggiamento laser.
3. Impostare l'apparecchiatura irraggiamento laser. Tenere la fibra laser e un diffusore da un morsetto su un supporto. Impostare la potenza del laser a basso livello e accendere il laser. Regolare l'altezza della fibra laser per ottenere una superficie di irradiazione del 9 mm di diametro (DPSS Laser, LaserGlow Technologies, Toronto, Canada), calibrare la potenza del laser di 750 mW (1.18 W / cm ²⁾ con apower metro e poi spegnere il laser per preparare gli animali.
4. Anestetizzare gli animali con 2% isoflurano v / v in 100% di gas di trasporto di ossigeno attraverso un'ogiva non scavenging evidente di isoflurano un pericolo rischio per la salute umana). Verificare che l'animale viene anestetizzato abbastanza profondo eseguendo un pizzico punta con una pinza o dita zampe posteriori dell'animale. Gli animali sono pronti per irraggiamento laser quando sono insensibili a questa procedura.
5. Monitorare la temperatura del tumore da una telecamera a infrarossi termica (Mikroshot, LumaSense Technologies). Posizionare la fotocamera vicino al tumore, concentrarsi bene e prendere una immagine pre PTT così come un normale immagine a luce bianca prima di PTT inizio di irradiazione.
6. Accendere il laser di nuovo, e aumentare il potere della luce a 750 mW. Posizionare il tumore nel centro del raggio laser per ottenere il tumore completamente coperto, e iniziare a programmare il calendario di irradiazione. Acquisire l'immagine temperatura tumore ogni 5 secondi per un trattamento laser un minuto. Spegnere il laser a 1 min. Stop la fornitura di gas del 2% isoflurano, attendere fino a quando le recupera animali provenienti anestesia e la rimise alla gabbia.
7. Mantenere i topi a normothermia stanza degli animali sotto 00:12 h ciclo buio e luce secondo protocolli animali approvati dalla University Health Network. Iniettare buprenorfina (0,05 mg / kg, per via sottocutanea due volte al giorno per una settimana dopo l'irradiazione laser per ridurre il dolore causato dalla cicatrice. Ogni due giorni, misurare il diametro del tumore usando un calibro e scattare una foto. Calcolare il volume del tumore usando l' seguente equazione: V = π / 6 · a · b ^2, dove a è il diametro lungo, e b è quello corto.
8. Sacrificare gli animali mettendoli in CO ₂ camera quando la lunga diametro del tumore raggiunge 10 mm, in quanto è il punto finale definito nel nostro laboratorio. Eseguire dislocazione cervicale dopo il trattamento CO2. Tracciare la curva di sopravvivenza.

Risultati

Pyropheophorbide è coniugato al fosfolipide come monomero lipidico stabile (Figura 1a) e coniugati auto-assemblano per formare porphysomes dal metodo di estrusione membrana utilizzando un estrusore ad alta pressione. Di solito è difficile estrudere sospensione porphysome lipidi durante i primi 3 cicli di estrusione con portata relativamente lento. Come più estrusi vengono ripetute, la velocità di flusso della soluzione estruso aumenta gradualmente, e la pressione può essere leggermente diminuita se nece...

Discussione

Nello sviluppo di tecnologie di drug delivery, nanoparticelle multifunzionali sono attualmente in fase di ampie ricerche per il monitoraggio accurato del veicolo di consegna della droga, pur mantenendo un elevato carico utile di droga. Porfirinici liposomi caricati sono stati sviluppati per migliori proprietà farmacocinetiche e consegna più efficiente rispetto alla somministrazione diretta di porfirina, ma esistono ostacoli, compresa la quantità di carico limitato di porfirina e rapida ridistribuzione di porfirina da li...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Evaporatore rotante	Thermo-Savant	SPD131DDA
Votex	Scientific Industries	SI-0236	Numero di modello: G560
Estrusore ad alta pressione	LIPEX, Northern Lipids Inc.	T.001	Estrusore Thermobarrel da 10 ml
Circolatori a bagno riscaldato (Termostatato)	Thermo SCIENTIFIC	SC100-S5P
Filtri in policarbonato	Avanti Polar Lipids	610005	Dimensione dei pori 100 nm e diametro della membrana 19 mm
Zetasizer	Malvern Instruments	ZS90
Spettrofotometro UV/Visibile	Varian Australia	Spettrofotometro UV/visibile Cary 50 Bio
		LRS-0671_PFN-02000-05	S/N:10097270
Termometro a infrarossi	Mikroshot, LUMASENSE Technologies	9102409
Occhiali protettivi laser	LaserGlow Technologies	AGF6602XX	Densità ottica: 1,5+ a 630-700 nm

Spettrofluorimetro HORIBA Scientific FluoroMax-4 Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)Incubatore per colture cellulari Hitachi H-7000 SANYO MCO-18AIC Powermeter Thorlabs PM100D con sensore S142C 671nm Laser LaserGlow Technologies