I sensori di fluorescenza sono strumenti potenti nella scienza della vita. Qui si descrive un metodo per sintetizzare ed utilizzare sensori fluorescenti basato dendrimero-per misurare il pH nelle cellule viventi e in vivo. L'impalcatura dendritiche esalta le proprietà dei coloranti fluorescenti coniugati che conducono al miglioramento delle caratteristiche di rilevamento.
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Articolo metodologico
Sintesi, Consegna Cellulare e
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo sviluppo di indicatori fluorescenti ha rappresentato una rivoluzione per le scienze della vita. Geneticamente codificato e fluorofori sintetici con capacità di rilevamento ha permesso la visualizzazione di specie biologicamente rilevanti con alta risoluzione spaziale e temporale. Coloranti sintetici sono di particolare interesse grazie alla loro elevata sintonizzabilità e la vasta gamma di analiti misurabili. Tuttavia, queste molecole soffrono di alcune limitazioni legate alla piccola comportamento della molecola (scarsa solubilità, difficoltà di targeting, spesso senza immagini ratiometric consentito). In questo lavoro si introduce lo sviluppo di sensori basati dendrimero e presentiamo una procedura per la misurazione del pH in vitro, in cellule viventi e in vivo. Abbiamo scelto dendrimeri come piattaforma ideale per i nostri sensori per le loro numerose proprietà desiderabili (monodispersity, proprietà sintonizzabili, multivalenza) che li un'impalcatura ampiamente utilizzato per diversi dispositivi biomedici fatte. La coniugazione di pH fluorescenteIndicatori al patibolo dendrimer portato ad un miglioramento delle loro prestazioni di rilevamento. In particolare dendrimeri mostre ridotto la perdita delle cellule, migliore il targeting intracellulare e permettere misurazioni raziometriche. Questi nuovi sensori sono stati impiegati con successo per misurare il pH nel vivere cellule HeLa e in vivo nel cervello di topo.
Introduzione
L'utilizzo di molecole fluorescenti per etichettare specifiche molecole biologicamente rilevanti ha completamente cambiato il nostro modo di studiare sistemi biologici. Widefield e microscopia confocale consentito in tempo reale ad alta risoluzione visualizzazione dei processi biologici e oggi sono tra le tecniche più popolari per studiare eventi biologici in vitro, in cellule e in vivo. 1 un miglioramento rilevante era rappresentata dallo sviluppo di indicatori di fluorescenza , cioè coloranti cui fluorescenza dipende dalla concentrazione di una entità molecolare specifico. pH e calcio indicatori, in particolare, hanno avuto....
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Protocollo
1. Sintesi dei sensori
- Nella sezione seguente forniamo una procedura per la coniugazione di indicatori di pH a dendrimeri PAMAM. Lo stesso protocollo può essere applicato con modifiche minime al dendrimeri ammina-cuscinetto alternativi. 5,17,13,14 dendrimeri e coloranti disponibili in commercio possono essere utilizzati senza ulteriori purificazioni.
- Sciogliere il dendrimer in DMSO anidro (concentrazione finale di 50 micron). Preparare soluzioni 10mM stock di fluoresceina NHS e tetrametil-rodamina-NHS (TMR) in DMSO anidro.
- Aggiungere alla soluzione dendrimero la quantità desiderata di fluoresceina e TMR. Il rapporto molare ne....
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Risultati
La Figura 1 mostra una rappresentazione schematica della coniugazione di rilevamento coloranti differenti scaffold dendritiche. Gli indicatori risultanti possono essere ottenuti in un solo passo sintetica facile da prodotti commercialmente disponibili. Dendrimeri ammina cuscinetti vengono fatti reagire con coloranti NHS attivati in DMSO e purificati mediante dialisi. Tale procedura generale è già stato utilizzato con successo per l'etichettatura di alcuni dendrimeri: i) generazione PAMAM dendrimer.......
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Discussione
Le fasi critiche per l'imaging pH con sensori basati dendrimero-sono: i) la selezione del ponteggio dendritica corretta e il numero di indicatori coniugati ad esso e ii) l'ottimizzazione di protocollo di recapito sensore in cellule o in vivo.
La procedura di sintesi è abbastanza semplice e può essere applicato praticamente ad ogni polimero hyperbranched ammina-cuscinetto. I sensori possono essere ottenuti da dendrimeri disponibili in commercio e coloranti NHS-attivati in u.......
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Dichiarazioni
Default: Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Utili discussioni con Isja de Feijter e Matt Baker sono riconosciuti con gratitudine.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| PAMAM G4 | Sigma-Aldrich | 412449 | |
| Carbossifluoresceina NHS estere | Life technologies | C-1311 | |
| TMR NHS estere | Life technologies | C-1171 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dyalsis bags | Spectrum Labs | 132117 | |
| WillCo Dishes | WillCo Wells | GWSt-3512 | |
| Uretano | Sigma-Aldrich | U2500 |
Riferimenti
- Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The Fluorescent Toolbox for Assessing Protein Location and Function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of ca2+ indicators w....
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Ristampe e permessi
