Qui si descrive un metodo generale per lo screening matrice microseed casuale. Questa tecnica è indicata per aumentare in modo significativo il tasso di successo di cristallizzazione della proteina esperimenti di screening, ridurre la necessità di ottimizzazione, e di fornire un approvvigionamento affidabile di cristalli per la raccolta di dati ed esperimenti ligando-ammollo.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Migliorare il tasso di successo di cristallizzazione della proteina da Random Microseed Matrix Screening
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo screening matrice microseed casuale (RMM) è una tecnica di cristallizzazione della proteina in cui cristalli di semi vengono aggiunti agli schermi casuali. Aumentando la probabilità che i cristalli crescono nella zona metastabile del diagramma di fase di una proteina, contatti supplementari cristallizzazione si ottengono spesso, la qualità dei cristalli prodotti può essere aumentata, e una buona scorta di cristalli per esperimenti di raccolta dati e da bagno sono forniti. Qui si descrive un metodo generale per RMM che possono essere applicati a entrambi seduti goccia o appesi esperimenti di diffusione di vapori goccia, stabiliti a mano o utilizzando la robotica di manipolazione dei liquidi, in formato vassoio 24-ben 96 pozzetti o.
Introduzione
Dalla sua domanda iniziale da Perutz, Kendrew e collaboratori nel determinare le strutture di emoglobina e mioglobina, ai moderni ad alto rendimento condotte automatizzati di genomica strutturale consorzi, macromolecolare cristallografia a raggi X ci ha offerto uno scorcio strutturale senza precedenti nel mondo della proteina . Questa tecnica rimane il metodo sperimentale più ampiamente applicabile che permette la visualizzazione diretta della struttura delle proteine a atomico, o vicino risoluzione atomica (cioè nell'intervallo 1-3 Å). Un prerequisito per diffrazione di raggi X da applicare a una proteina è che deve prima essere cristallizzato, ed è q....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Considerazioni strategiche
- La scelta di semi-cristalli utilizzato per esperimenti microseeding varierà a seconda dell'obiettivo dell'esperimento. All'inizio di un progetto è utile per trovare diversi colpi di cristallizzazione che possono fornire punti di partenza alternativi per l'ottimizzazione di cristallo. RMM riduce notevolmente la necessità di ottimizzazione cristallo perché i cristalli di buona qualità hanno maggiori probabilità di crescere nella zona metastabile del diagramma di fase, cioè nella regione in cui segue perturbazione o nucleazione il sistema ritorna all'equilibrio. È pertanto consigliabile utilizzare RMM....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
(A) Esempio di un esperimento RMM
Per dimostrare l'efficacia dello screening RMM abbiamo applicato questo metodo per la cristallizzazione di gallina albume lisozima (HEWL) e del fegato bovino catalasi (BLC). Entrambi questi enzimi sono eminentemente cristallizzabile e sono strutturalmente obiettivi 15, 16 ben caratterizzati. Come tale entrambi forniscono ottimi soggetti di prova con cui illustrare il tasso di successo di cristallizzazione maggiore ottenibile con RMM. Esperimenti .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
In questo articolo abbiamo descritto un metodo generale per lo screening RMM la cristallizzazione della proteina. Abbiamo dimostrato con due proteine di prova di un aumento significativo nel tasso di successo di cristallizzazione con questo metodo. Analisi di diffrazione con radiazione di sincrotrone di un sottoinsieme di cristalli generati utilizzando RMM e metodi non RMM rivelato piccola variazione nella qualità di diffrazione tra i cristalli coltivati utilizzando entrambi i metodi, anche se gli autori precedenti .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato in parte dalla BBSRC (BB/1006478/1). PRR è il destinatario di un Royal Society University Research Fellowship.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vassoi di cristallizzazione a 96 pozzetti MRC | Dimensioni molecolari Ltd | MD11-00-100 | Non compatibile con i raggi UV, per schermi stabiliti da |
| robot Fogli sigillanti ClearView | Dimensioni molecolari Ltd | MD6-01S | |
| Liozima albume d'uovo di gallina | Sigma-Aldrich | L6876 | ~95% di purezza |
| Catilasi di fegato bovino | Sigma-Aldrich | C9322 | Purezza 95% |
| Xylanase | Hampton Research | HR7-104 | |
| Taumatina da Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | T7630 | |
| Termolisina da Bacillus thermoproteolyticus rokko | Sigma-Aldrich | P1512 | |
| JCSG-plus HT-96 schermo | Molecular Dimensions Ltd | MD1-40 | Per schermi stabiliti dal robot |
| PACT premier HT-96 schermo | Molecular Dimensions Ltd | MD1-36 | Per schermi stabiliti dal robot |
| Morpheus HT-96 schermo | Molecular Dimensions Ltd | MD1-47 | Per schermi stabiliti dal robot |
| Crystal Ph– sistema di manipolazione dei liquidi nix | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
| Kit di perline | Hampton Research | HR2-320 | |
| Stereomicroscopio binoculare | Leica | M165C | |
| Lame per bisturi | Sigma-Aldrich | S2646-100EA | |
| ErgoOne 0,1-2,5 μ l pipetta | Starlab | S7100-0125 | |
| ErgoOne 2-20 μ l pipetta | Starlab | S7100-0221 | |
| ErgoOne 100-1000 μ l pipetta | Starlab | S7100-1000 | |
| Schermo JCSG-plus | Molecular Dimensions Ltd | MD1-37 | Per schermi stabiliti a mano |
| Schermo PACT premier Molecular | Dimensions Ltd | MD1-29 | Per schermi stabiliti a mano |
| Schermo Morpheus Molecular | Dimensions Ltd | MD1-46 | Per schermi stabiliti a mano |
| Pinzette | Sigma-Aldrich | T5415-1EA | |
| CrystalClene vetrini coprioggetti 18 mm | Dimensioni molecolari Ltd | MD4-17 | |
| Pipette Pasteur in vetro da 2 ml Miscelatore | Sigma-Aldrich | Z722669 | |
| Fisher Scientific | 02-215-360 | ||
| Vassoio di cristallizzazione XRL a 24 pozzetti | Dimensioni molecolari limitate | MD3-11 | Per schermi stabiliti a mano |
| 30% (p/v) PEG 8000, 0,2 M solfato di ammonio, 0,1 M cacodilato di sodio pH 6,5 | |||
| 20% (p/v) PEG 8000, 0,2 M acetato di magnesio, 0,1 M cacodilato di sodio pH 6,5 | |||
| 20% (p/v) PEG 6000, 100 mM acido citrico pH 5,0 |
Riferimenti
- Bergfors, T. Protein Crystallization. IUL Biotechnology Series. , 2nd, (2009).
- Rupp, B. Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , Garland Science. (2010).
- Babnigg, G., Joachimiak, A.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
