Descriviamo l'uso di coloranti stirilico FM per l'immagine riciclo delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi funzionali. Questo protocollo può essere applicato non solo evocata, ma anche spontanea e attività sinaptiche in miniatura. Il protocollo espande la varietà di eventi sinaptici che possono essere adeguatamente valutati.
Articolo metodologico
Esame delle vescicole sinaptiche Riciclaggio Uso FM coloranti Durante evocati, spontaneo, e miniatura Attività Synaptic
In questo articolo
Sommario
Abstract
Vescicole sinaptiche nelle terminazioni nervose funzionali subiscono esocitosi e endocitosi. Questo riciclo delle vescicole sinaptiche può essere efficacemente analizzata utilizzando coloranti stirilico FM, che rivelano fatturato membrana. Protocolli convenzionali per l'uso di coloranti FM sono stati progettati per analizzare neuroni seguente stimolata (evocati) attività sinaptica. Recentemente, protocolli sono resi disponibili per analizzare i segnali FM che accompagnano attività sinaptica deboli, come eventi sinaptici spontanei o miniatura. L'analisi di queste piccole variazioni di segnali FM richiede che il sistema di imaging è sufficientemente sensibile per rivelare piccole variazioni di intensità, ma che i cambiamenti artefatti di grande ampiezza vengono soppressi. Qui si descrive un protocollo che può essere applicato a evocata, spontanea, e attività sinaptiche in miniatura, e utilizzando colture di neuroni ippocampali come esempio. Questo protocollo incorpora anche un mezzo per determinare il tasso d'photobleaching di coloranti FM, in quanto questo è un significativofonte di artefatti quando di imaging piccole variazioni di intensità.
Introduzione
La funzionalità di vescicole sinaptiche è un importante determinante della trasmissione sinaptica. Tali vescicole rilasciano neurotrasmettitori quando si fondono con la membrana plasmatica presinaptica (esocitosi), e sono pronte per un altro ciclo di stampa dopo essere rigenerata dalla membrana plasmatica (endocitosi) e ricaricato con neurotrasmettitore. La ricerca sulla dinamica dei meccanismi sottostanti e riciclo delle vescicole sinaptiche è stata notevolmente accelerato dall'introduzione di coloranti styryl FM 1. Queste molecole anfipatiche, che hanno carica positiva gruppi di testa idrofile e code idrofobiche (più coloranti in figura 1A,
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Protocollo
1. Cultura primarie di neuroni dal cervello dei mammiferi
Tutte le procedure sugli animali eseguiti in questo studio sono approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali e uso della University of Iowa.
- Preparare la coltura cellulare dissociata delle regioni CA3-CA1 dell'ippocampo di topi o ratti a giorni postnatali 0-1 19,20. Piastra le cellule dell'ippocampo sulle lamelle 12 mm (spessore numero 0) preconfigurate con lo strato alimentatore ratto gliali, in piatti da 24 pozzetti, e ad una densità di 12.000 cellule / pozzetto.
- Cultura i neuroni dell'ippocampo per almeno 8 giorni per i term....
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Risultati
Come esempio, mostriamo risultati rappresentativi per il decorso decolorante di vescicole sinaptiche (Figura 4). Neuroni dell'ippocampo in coltura sono state colorate con FM4-64 utilizzando l'attività sinaptica spontanea (fase 2.3) e lavato con una soluzione priva di colorante (soluzione di risciacquo 2). La rappresentazione mostra l'andamento iniziale tempo decolorante utilizzando attività spontanea (passo 5.3) (parte iniziale della linea continua, Figura 4A). Segue il deco.......
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Discussione
Abbiamo descritto protocolli per la colorazione e decolorazione vescicole sinaptiche in risposta evocata, attività sinaptica spontanea e miniatura, e per l'imaging durante la fase di decolorazione. Oltre ai protocolli esistenti, abbiamo incluso un nuovo protocollo di osservare il decolorante FM basato su attività sinaptica miniatura. L'utilizzo di questi protocolli, abbiamo precedentemente identificato anomalie nei neuroni in coltura da un modello murino della malattia movimento distonia. In confronto alle loro .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano i membri del laboratorio Harata per utili discussioni durante l'esecuzione di questo lavoro. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dal American Heart Association, la distonia Fondazione di ricerca medica, l'Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, la National Science Foundation e la Fondazione Whitehall a NCH
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Generatore di impulsi | AMPI | Master-8 | |
| Stimolatore isolato |  Digitimer | DS3 | |
| Microscopio invertito | Nikon | Eclipse TS100 | Viene utilizzato per valutare la morfologia cellulare a basso ingrandimento. |
| Microscopio invertito | Nikon | Eclipse TiE | Viene utilizzato per l'acquisizione di immagini in fluorescenza e in luce trasmessa ad alta risoluzione, con minima deriva del fuoco. |
| Obiettivo | Nikon | Si consiglia un obiettivo ad immersione in acqua. Un obiettivo ad immersione in olio può essere utilizzato a meno che la struttura da immagine non si trovi a grande profondità rispetto alla superficie del coprioggetto (e.g. >10 μm). | |
| Cubo filtro | Nikon | 77032509 | 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em per FM1-43 |
| Cubo filtro | Nikon | 77032809 | 490/420 nm ex, 510 nm dclp, 650 nm LP em per FM4-64. |
| Camera EMCCD | Andor Technology | iXon EM+ DU-860 | Questa camera EMCCD viene utilizzata per la rilevazione ad alta sensibilità della fluorescenza. |
| Chiller a circolazione liquida | Solid State Cooling Systems | Oasis 160 | Viene utilizzato per perfondere continuamente la camera con acqua refrigerata al fine di mantenere una temperatura di -80°C, riducendo così il rumore. |
| LED | CoolLED-Custom Interconnect | 490 nm | Questa sorgente luminosa viene utilizzata per il controllo rapido di accensione/spegnimento dell'eccitazione della fluorescenza. |
| Software di acquisizione immagini | Andor Technology | Solis | |
| Camera di imaging | Warner Instruments | RC-21BRFS | |
| Sistema di perfusione rapida | Warner Instruments | SF-77B | |
| CNQX | Tocris Bioscience | 1045 | |
| D,L-AP5 | Tocris Bioscience | 0106 | |
| Tetrodotossina | Tocris Bioscience | 1069 | Attenzione: reagente tossico. Manipolare con cautela. |
| FM1-43 | Invitrogen | T35356 | |
| FM1-43 fissabile con aldeidi (FM1-43FX) | Invitrogen | F35355 | |
| FM4-64 | Invitrogen | T13320 | |
| FM4-64 fissabile con aldeidi (FM4-64FX) | Invitrogen | F34653 | |
| Ionomicina | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| Sale fisiologico equilibrato di Hanks’ | Sigma-Aldrich | H2387 | |
| Mezzo Essenziale Minimo | Invitrogen | 51200-038 | Questa soluzione non contiene rosso fenolo, che potrebbe interferire con l'imaging in fluorescenza. |
| Paraformaldeide | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Attenzione: reagente tossico. Manipolare con cautela. |
| Saccarosio | Sigma-Aldrich | S7903 |
Riferimenti
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat. Protoc. 1
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