Cella della morte associata a mitosi anomalo osservato da Imaging confocale in cellule vive di cancro

Sommario

L'attività citotossica della fenantridina PJ-34 in cellule tumorali in mitosi è stata documentata in tempo reale dai confocale vivo. PJ-34 sradicato cancro al seno umano MDA-MB-231 cellule che ospitano in più-centrosomi nella mitosi. A differenza della normale mitosi bi-focale, l'extra-centrosomi non sono stati raggruppati in due poli del fuso in presenza di PJ-34.

Abstract

Derivati ​​Fenantrene che agiscono come potenti inibitori PARP1 impedito il raggruppamento bi-focale di centrosomi soprannumerari nelle celle multi-centrosomica tumorali umane in mitosi. Il fenantridina PJ-34 è stata la più potente molecola. Declustering di extra-centrosomi provoca insufficienza mitotico e la morte cellulare nelle cellule multi-centrosomica. Tumori umani più solidi hanno alta presenza di extra-centrosomi. L'attività di PJ-34 è stata documentata in tempo reale da imaging confocale di cancro al seno umano vivo MDA-MB-231 cellule trasfettate con vettori codificanti per fluorescente γ-tubulina, che è altamente abbondante nei cntrosome e per fluorescente istone H2b presente in i cromosomi. Cromosomi aberranti arrangiamenti e de cluster-foci γ-tubulina che rappresentano centrosomi declustered sono stati rilevati nelle transfettate cellule MDA-MB-231 dopo il trattamento con PJ-34. Un-cluster in più-centrosomi nei due poli del fuso preceduto la loro morte cellulare. Questi risultati legati for la prima volta l'attività citotossica esclusivo recentemente rilevata del PJ-34 in cellule tumorali umane con supplemento cntrosome-de-clustering in mitosi e insufficienza mitotico che porta alla morte cellulare. Secondo i risultati precedenti osservati con l'imaging confocale di cellule fisse, PJ-34 cellule tumorali debellata esclusivamente con il multi-centrosomi senza danneggiare le cellule normali subiscono mitosi con due centrosomi e mandrini bi-focale. Questa attività citotossica di PJ-34 non è stata condivisa da altri potenti inibitori PARP1, ed è stata osservata in PARP1 deficienti MEF extracentrosomes ospitano, suggerendo la sua indipendenza di PARP1 inibizione. Vivere confocale offerto uno strumento utile per l'individuazione di nuove molecole sradicare le cellule durante la mitosi.

Introduzione

Fenantrene deriva inibitori PARP1, tra cui PJ-34, sono stati progettati per proteggere le cellule quiescenti di morte cellulare per apoptosi indotta dal consumo di energia PARP1 mediata riparazione del DNA in condizioni di stress (ictus o infarto del miocardio) ^1. Tuttavia, di recente abbiamo scoperto che PJ-34, a concentrazione due volte più alta di quella che induce PARP1 inibizione, può causare la morte delle cellule esclusivamente in cellule tumorali umane ^2,3. Più rapida è la proliferazione della cellula era, più efficiente l'eradicazione delle cellule era. L'attività citotossica di PJ-34 è stato attribuito a extra-centrosomi de-clustering in mitosi ^2. Molte cellule tumorali porto umano multicentrosomes ^4,5. Incubazione di cellule umane di cancro al seno MDA-MB-231, che ospitano centrosomi soprannumero, con 20 micron PJ-34 efficientemente debellate queste cellule entro 72-96 ore senza danneggiare le cellule quiescenti o alcuni proliferativi benigni ospitare due centrosomi in mitosi ^{2,3. Cellule benigne incluse cellule epiteliali mammarie umane MCF-10, cellule endoteliali umane (HUVEC) e cellule mesenchimali primari preparati da timo umano. Queste cellule erano resistenti alla attività citotossica di PJ-34. PJ-34 non ha interferito con il loro ciclo cellulare durante le 96 ore di incubazione o influenzare i loro centrosomi e formazione del fuso bi-focale 2,3.}

Bipolare assemblea centrosoma è cruciale per la formazione del fuso bipolare in mitosi ^4,5. Pertanto, le cellule con più di due centrosomi hanno sviluppato un meccanismo molecolare poco capito, raggruppando i loro centrosomi ai due poli ^4-9. Fallimento di montaggio bipolare dei loro centrosomi può causare multipolare distorto mandrini e aberrante cromosomi segregazione che arresta il ciclo cellulare in G2 / M arresto, e porta alla morte cellulare attribuite al fallimento mitotico ^4,5. I meccanismi molecolari alla base di olio extra-centrosomi de-cluster sono intensamente studiate ^{10. La comprensione di questo meccanismo di morte consentirà eradicazione esclusivo delle cellule tumorali risparmiando i tessuti sani 5,10.}

Così, composti che attivano la morte cellulare mitotico catastrofe offrono una nuova modalità di una terapia del cancro selettivo, che può essere efficace in una vasta gamma di risultati cancers.Our solidi umani suggeriscono che l'imaging confocale può essere utilizzato per identificare molecole che influenzano extra-cntrosome clustering in mitosi ^2,3, rendendo questi composti cancro mira candidati farmaci.

Abbiamo documentato l'attività citotossica del fenantridina PJ-34 tramite la scansione cellule tumorali umane fisse e vivo (con alta presenza di extra-centrosomi in mitosi) contro le cellule normali. Un passo-passo le procedure di imaging utilizzate per identificare l'attività citotossica di PJ-34 in cellule tumorali umane di seguito è incluso.

Protocollo

1. Cell Culture Preparazione

MDA-MB-231 cellule sono state acquistate da ATCC (American Type Culture Collection) e conservati in azoto liquido.

1. Seed 10 ⁶ MDA-MB-231 cellule nel diametro 92 mm piastra di Petri in 10 ml di terreno completo contenente Dulbeco Modified Eagle Medium (DMEM), 10% siero di cavallo, 1% di L-glutammina, e 1% Penstrep-amfotericina B. Consentono alle cellule di proliferare a circa 80-100% di confluenza.
2. Togliere terreno di coltura dal piatto e scartare.
3. Lavare lo strato cella brevemente con 0,25% (w / v) Tripsina-EDTA soluzione per eliminare ogni traccia di siero.
4. Aggiungere 2,0 ml di soluzione di tripsina-EDTA per piatto e osservare le cellule al microscopio invertito fino strato di cellule viene dispersa (di solito entro 5-15 min).
5. Aggiungere 18 ml di terreno di crescita completo e aspirare delicatamente le cellule dalla pipetta. Trasferire in una provetta.
6. Centrifugare la sospensione cellulare a 1.200 giri al minuto.
7. Risospendere il pellet cellulare in 24 ml di culture medie.
8. Aggiungere 2 ml di sospensione cellulare a 35 millimetri di vetro piatti inferiori (circa il 25% di confluenza) e posto in incubatore (5% di CO _2, 37 ° C).
9. Soluzioni:
   1. Terreno completo per la proliferazione delle cellule: DMEM con 10% FBS, 1% Antibiotici (100 unità / ml di penicillina G, 100 mg / ml di streptomicina, soluzione Pen-Strep-Ampho) e 2 mM L-glutammina.
   2. Soluzione di tripsina-EDTA, contenente 0,25% tripsina-EDTA.
10. Piatti:
    Diametro 92 mm Petri.
    35 mm Diametro poli-D-lisina rivestite con fondo di vetro piatti della cultura.

2. Preparazione di cellule per Live confocale

1. Seed 2 x 10 ⁵ MDA-MB-231 cellule nel fondo di vetro piatti cultura in 2 ml di terreno completo come indicato nella sezione 1. Quando la coltura cellulare raggiunge confluenza del 60-70% (circa 3-4 x 10 ⁵ cellule per piatto), procedere con la trasfezione.
2. Trasfezione le cellule con due plasmidi ENCODzione delle proteine ​​di fusione γ-tubulina-GFP (per la rilevazione fluorescente di centrosomi) e istone-RED (H2b-RED, per la rilevazione fluorescente dei cromosomi) utilizzando il reagente di trasfezione liposomiale Jet-PI, seguendo il protocollo di produzione. Brevemente, mescolare 2 ug di ciascun plasmide in un tubo con 100 microlitri di NaCl (150 mM). Mescolare il reagente di trasfezione (100 pl) con 100 microlitri di NaCl (150 mM) in un secondo tubo, e incubare 5 min a temperatura ambiente (RT). Poi unire le due soluzioni, miscela (con vortice lieve) e spin-down. Incubare per 30 min a RT.
3. Durante l'incubazione della miscela di trasfezione, lavare le cellule una volta con PBS e sostituire il mezzo cella con 2 ml di DMEM caldo senza integratori (37 ° C).
4. Aggiungere delicatamente la miscela di trasfezione per le cellule in DMEM e poi tornare celle verso l'incubatore (37 ° C, 5% CO ₂₎ per 8 ore.
5. Dopo 8 ore di incubazione, sostituire il DMEM con 2 ml di mezzo completo e incubare le cellule in incubatore per 24hr.
6. 24 ore dopo la trasfezione, sostituire il medium delle cellule con 2 ml di terreno completo contenente 20 mM PJ-34.
7. Incubare le cellule per ulteriori 18 ore (37 ° C, 5% CO _2).
8. Oggetto le cellule a vivere confocale per almeno 16 ore in camera di imaging mantenere le cellule al 5% di CO ₂ e 37 ° C.
9. In parallelo, esaminare l'efficacia di trasfezione 36 ore dopo la trasfezione usando la microscopia a fluorescenza come segue:
   1. Seme 2 x 10 ⁵ MDA-MB-231 cellule in piastra da 6 pozzetti contenente 1 coprioggetto per pozzetto in 2 ml di mezzo completo.
   2. Trasfezione le cellule come accennato nelle sezioni 2,2-2,5.
   3. 36 ore dopo la trasfezione fissare le cellule transfettate montati su un vetrino da incubazione in metanolo freddo: acetone (1:1) soluzione, 7 min, -20 ° C.
   4. Aspirare la soluzione di fissaggio e lasciare che il vetrino con le cellule montati a secco in una cappa chimica.
   5. Applicare Prolungare reagente antifade Oro con DAPI e lasciate °e vetrino ad asciugare al buio per 6 ore.
   6. Esaminare il vetrino al microscopio a fluorescenza e di calcolare la percentuale di cellule trasfettate (segnali rosso e verde) della popolazione totale di cellule (colorazione del DNA con DAPI). La percentuale desiderata transfezione è circa 20-40% 100-200 quando le cellule sono contate.

3. Parametri tecnici delle impostazioni dello scanner confocale in diretta

1. ScanMode XYZT; Pinhole [arioso] 1,00; Zoom 3,5; Risoluzione 8 bit; laser DPSS 561 nm; argon, laser visibile a 488 nm laser He / Ne visibile 633 nm; Obiettivo HCX PL APO CS 63X 1.40 OLIO UV; Apertura numerica 1.4; Velocità di scansione 700 Hz; indice di rifrazione 1.52.
2. Immagine 3-D di presentazione sono stati preparati da Imaris di imaging software 7.0.

4. Confocale di mitosi in cellule fissate

1. Seed 2 x 10 ⁵ MDA-MB-231 delle cellule di cancro al seno (ATCC), normali fibroblasti embrionali di topo (MEF), o PARP1 carente MEF (PARP ^{- / -,} preparato dal dottor Francoise Dantzer) su vetrini in 6 pozzetti in 2 ml di terreno completo. Coprioggetto sono stati lavati con etanolo al 96%, in seguito da lavaggio con acqua sterile DD, asciugata per 2 ore, e collocato in ciascun pozzetto di piatto 6-bene.
2. Aggiungere PJ-34 (10-30 mM) al mezzo e incubare le cellule per il periodo necessario (di solito fino a 96 ore).
3. Lavare i coprioggetti una volta con PBS (tampone fosfato), e fissare le cellule utilizzando incubazione in metanolo ghiacciata: (1:1) soluzione di acetone, 7 min, -20 ° C.
4. Aspirare la soluzione di fissaggio e lasciare che i coprioggetti ad asciugare in cappa chimica (in questa fase, i vetrini possono essere conservati a -20 ° C per diverse settimane).
5. Lavare i coprioggetti una volta con PBST (PBS supplementato con 0,1% di Tween-20) per permeabilize le membrane cellulari e di bloccare le cellule con 10% NDS (asino siero normale) in PBST ('soluzione bloccante') per 1 ora a RT.
6. Incubare le cellule fisse permeabilizzate con Antibodi primariaes per 2 ore a temperatura ambiente (per i mandrini e centrosomi colorazione). Gli anticorpi sono diluiti nella soluzione bloccante come seguono: tubulina anti-α (diluizione 1:250) e anti-tubulina γ (diluizione 1:200). Anticorpi primari sono applicati come segue: applicare 100 microlitri (in una goccia) di una miscela di anticorpi in soluzione per ogni coprioggetto bloccaggio sulla copertina 6 pozzetti (il coperchio è capovolto). Mettere delicatamente il vetrino sulla goccia anticorpi, le cellule seminate di fronte alla caduta. Incubare i coprioggetti rivolti gli anticorpi per 2 ore a temperatura ambiente.
7. Posizionare i coprioggetti indietro nei pozzetti e lavare le cellule 3 volte con PBST. Quindi utilizzare la stessa procedura descritta in 4.6 per etichettare le cellule sui vetrini con gli anticorpi secondari fluorescenti. Incubare le cellule sui vetrini con gli anticorpi secondari per 1 ora, RT, al buio. Gli anticorpi sono diluiti in soluzione di blocco come segue: Alexa Fluor 488 (diluizione 1:1000; verde) e Alexa Fluor 568 (diluizione 1:1000;rosso).
8. Montare il coprioggetto utilizzando prolungare reagente antifade Oro con DAPI (per i cromosomi colorazione) e incubare una notte a temperatura ambiente al buio per asciugare.
9. Esaminare i vetrini al microscopio confocale.

5. La vitalità cellulare Misurato da produzione di ATP

Produzione di ATP è misurata da un kit di analisi ATP rilevamento luminescente.

1. Seed le cellule in piastra a 96 pozzetti, circa 20.000 cellule in 800 microlitri media in ciascun pozzetto. Tre pozzi vuoti dovrebbero essere utilizzati per la determinazione dello sfondo luminescenza del mezzo.
2. Preparare una serie di diluizioni standard di ATP da circa 10 micron a 100 micron e tenere in ghiaccio.
3. Aggiungere 50 ml di detersivo per ogni pozzetto e agitare la piastra per 5 minuti in agitatore orbitale, 700 giri.
4. Ricostituire ciascun flacone di 'sostrato liofilizzato' con 5 ml di 'tampone substrato' nel kit.
5. Aggiungere 50 ml della soluzione di substrato ricostituito ai pozzetti, e agitarela piastra per 5 minuti su agitatore orbitale, 700 giri.
6. Tenere la piastra al buio per 10 minuti.
7. Misurare luminescenza di ogni bene da ELISA lettore di micropiastre.

Risultati

PJ-34 è un acqua stabile solubile fenantridina ¹ (Figura 1). I nostri risultati precedenti hanno rivelato la morte cellulare e la de-raggruppati extra-centrosomi in diversi tipi di cellule tumorali a più centrosomica fissi che sono stati trattati con PJ-34. Al contrario, le cellule proliferanti normali non hanno perso di valore ^2,3. Centrosomi sono stati identificati mediante doppia marcatura con anticorpi diretti contro centrine1 e γ-tubulina nelle cellule fisse extra-centrosomica...

Discussione

In diretta confocale ha fornito una documentazione in tempo reale l'effetto citotossico di PJ-34 in cellule multi-centrosomica dal vivo durante la mitosi (figura 3 e le informazioni supplementari). Questa è stata la prima documentazione vivo attribuendo la citotossicità di PJ-34 in cellule tumorali umane di centrosomi de-clustering e di morte cellulare, suggerendo l'induzione di morte cellulare mitotica Catastrophe da PJ-34 ^5-9. Al contrario, il clustering bi-focale di centrosomi supe...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
REAGENTS
DMEM	Invitrogen (GIBCO)	41965
FBS (Siero fetale bovino)	Invitrogen (GIBCO)	12657
Soluzione Pen-Strep-Ampho	Biological Industries, Israele	03-033-1B
L-glutammina	Invitrogen (GIBCO)	25030-024
0,25% tripsina-EDTA	Invitrogen (GIBCO)	25200
Piastre di Petri 92 mm	Nunc,Thermo scientific	150350
Piastre di coltura con fondo in vetro rivestito in poli-D-lisina da 35 mm	MatTek Corporation, USA	P35GC-0-14-C
Kit di test di rilevamento ATP luminescente	Abcam	ab113849
NDS (siero d'asino normale)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Anticorpo anti &alfa;-tubulina	Sigma	T9026	diluizione 1:250 (IF)
Anticorpo anti γ-tubulina	Sigma	T5192	diluizione 1:200 (IF)
Alexa Fluor 488 Capra Anti-Topo IgG	Invitrogen	A-11017	1:1.000 diluizione (IF)
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG	Invitrogen	A-10042	1:1.000 diluizione (IF)
Reagente antisbiadimento ProLong Gold con DAPI (montaggio)	Invitrogen	P36935
JetPEI (reagente di trasfezione liposomiale) Polyplus		101-10
EQUIPMENT
Microscopio confocale	Leica (Mannheim, Germania)	TCS SP5II&	nbsp;