Cella della morte associata a mitosi anomalo osservato da Imaging confocale in cellule vive di cancro

Sommario

L'attività citotossica della fenantridina PJ-34 in cellule tumorali in mitosi è stata documentata in tempo reale dai confocale vivo. PJ-34 sradicato cancro al seno umano MDA-MB-231 cellule che ospitano in più-centrosomi nella mitosi. A differenza della normale mitosi bi-focale, l'extra-centrosomi non sono stati raggruppati in due poli del fuso in presenza di PJ-34.

Abstract

Derivati ​​Fenantrene che agiscono come potenti inibitori PARP1 impedito il raggruppamento bi-focale di centrosomi soprannumerari nelle celle multi-centrosomica tumorali umane in mitosi. Il fenantridina PJ-34 è stata la più potente molecola. Declustering di extra-centrosomi provoca insufficienza mitotico e la morte cellulare nelle cellule multi-centrosomica. Tumori umani più solidi hanno alta presenza di extra-centrosomi. L'attività di PJ-34 è stata documentata in tempo reale da imaging confocale di cancro al seno umano vivo MDA-MB-231 cellule trasfettate con vettori codificanti per fluorescente γ-tubulina, che è altamente abbondante nei cntrosome e per fluorescente istone H2b presente in i cromosomi. Cromosomi aberranti arrangiamenti e de cluster-foci γ-tubulina che rappresentano centrosomi declustered sono stati rilevati nelle transfettate cellule MDA-MB-231 dopo il trattamento con PJ-34. Un-cluster in più-centrosomi nei due poli del fuso preceduto la loro morte cellulare. Questi risultati legati for la prima volta l'attività citotossica esclusivo recentemente rilevata del PJ-34 in cellule tumorali umane con supplemento cntrosome-de-clustering in mitosi e insufficienza mitotico che porta alla morte cellulare. Secondo i risultati precedenti osservati con l'imaging confocale di cellule fisse, PJ-34 cellule tumorali debellata esclusivamente con il multi-centrosomi senza danneggiare le cellule normali subiscono mitosi con due centrosomi e mandrini bi-focale. Questa attività citotossica di PJ-34 non è stata condivisa da altri potenti inibitori PARP1, ed è stata osservata in PARP1 deficienti MEF extracentrosomes ospitano, suggerendo la sua indipendenza di PARP1 inibizione. Vivere confocale offerto uno strumento utile per l'individuazione di nuove molecole sradicare le cellule durante la mitosi.

Introduzione

Fenantrene deriva inibitori PARP1, tra cui PJ-34, sono stati progettati per proteggere le cellule quiescenti di morte cellulare per apoptosi indotta dal consumo di energia PARP1 mediata riparazione del DNA in condizioni di stress (ictus o infarto del miocardio) ^1. Tuttavia, di recente abbiamo scoperto che PJ-34, a concentrazione due volte più alta di quella che induce PARP1 inibizione, può causare la morte delle cellule esclusivamente in cellule tumorali umane ^2,3. Più rapida è la proliferazione della cellula era, più efficiente l'eradicazione delle cellule era. L'attività citotossica di PJ-34 è stato attribuito a extra-centrosomi de-clu....

Protocollo

1. Cell Culture Preparazione

MDA-MB-231 cellule sono state acquistate da ATCC (American Type Culture Collection) e conservati in azoto liquido.

1. Seed 10 ⁶ MDA-MB-231 cellule nel diametro 92 mm piastra di Petri in 10 ml di terreno completo contenente Dulbeco Modified Eagle Medium (DMEM), 10% siero di cavallo, 1% di L-glutammina, e 1% Penstrep-amfotericina B. Consentono alle cellule di proliferare a circa 80-100% di confluenza.
2. Togliere terreno di coltura dal piatto e scartare.
3. Lavare lo strato cella brevemente con 0,25% (w / v) Tripsina-EDTA soluzione per eliminare ogni traccia di siero.

Risultati

PJ-34 è un acqua stabile solubile fenantridina ¹ (Figura 1). I nostri risultati precedenti hanno rivelato la morte cellulare e la de-raggruppati extra-centrosomi in diversi tipi di cellule tumorali a più centrosomica fissi che sono stati trattati con PJ-34. Al contrario, le cellule proliferanti normali non hanno perso di valore ^2,3. Centrosomi sono stati identificati mediante doppia marcatura con anticorpi diretti contro centrine1 e γ-tubulina nelle cellule fisse extra-centrosomica.......

Discussione

In diretta confocale ha fornito una documentazione in tempo reale l'effetto citotossico di PJ-34 in cellule multi-centrosomica dal vivo durante la mitosi (figura 3 e le informazioni supplementari). Questa è stata la prima documentazione vivo attribuendo la citotossicità di PJ-34 in cellule tumorali umane di centrosomi de-clustering e di morte cellulare, suggerendo l'induzione di morte cellulare mitotica Catastrophe da PJ-34 ^5-9. Al contrario, il clustering bi-focale di centrosomi supe.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
REAGENTS
DMEM	Invitrogen (GIBCO)	41965
FBS (Siero fetale bovino)	Invitrogen (GIBCO)	12657
Soluzione Pen-Strep-Ampho	Biological Industries, Israele	03-033-1B
L-glutammina	Invitrogen (GIBCO)	25030-024
0,25% tripsina-EDTA	Invitrogen (GIBCO)	25200
Piastre di Petri 92 mm	Nunc,Thermo scientific	150350
Piastre di coltura con fondo in vetro rivestito in poli-D-lisina da 35 mm	MatTek Corporation, USA	P35GC-0-14-C
Kit di test di rilevamento ATP luminescente	Abcam	ab113849
NDS (siero d'asino normale)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Anticorpo anti &alfa;-tubulina	Sigma	T9026	diluizione 1:250 (IF)
Anticorpo anti γ-tubulina	Sigma	T5192	diluizione 1:200 (IF)
Alexa Fluor 488 Capra Anti-Topo IgG	Invitrogen	A-11017	1:1.000 diluizione (IF)
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG	Invitrogen	A-10042	1:1.000 diluizione (IF)
Reagente antisbiadimento ProLong Gold con DAPI (montaggio)	Invitrogen	P36935
JetPEI (reagente di trasfezione liposomiale) Polyplus		101-10
EQUIPMENT
Microscopio confocale	Leica (Mannheim, Germania)	TCS SP5II&	nbsp;