Qui mostriamo come citometria immagine può essere utilizzato per la quantificazione dei funghi patogeni in associazione con cellule ospiti in coltura. Questa tecnica può essere utilizzata come alternativa al CFU enumerazione.
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Articolo metodologico
L'uso di Citometria immagine per la quantificazione dei funghi patogeni in associazione con cellule ospiti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Studi dei meccanismi di patogenesi cellulari di lieviti patogeni come la Candida albicans, capsulatum Histoplasma e Cryptococcus neoformans comunemente impiegano infezione di ospiti mammiferi o cellule ospitante (cioè macrofagi) seguita da quantificazione lievito utilizzando formanti colonie analisi unità o citometria a flusso. Mentre unità formanti colonia enumerazione è stato il metodo più comunemente utilizzato in campo, questa tecnica ha degli svantaggi e limitazioni, tra cui lenta crescita di alcune specie fungine su supporti solidi ed efficienze basse e / o variabile placcatura, il che è di particolare interesse quando si confrontano crescita di ceppi wild-type e mutanti. Citometria di flusso può fornire informazioni quantitative relative rapida vitalità del lievito, tuttavia, adozione mediante citometria a flusso per lieviti patogeni è stato limitato per una serie di ragioni pratiche tra cui il suo biosicurezza considerazioni costo elevato e. Qui, dimostriamo una immagine basata sumetodologia citometria utilizzando la Vision Cellometer (Nexcelom Bioscience, LLC) per la quantificazione dei lieviti patogeni vitali in co-coltura con macrofagi. I nostri studi si concentrano sulla individuazione di due funghi patogeni umani: capsulatum Histoplasma e Candida albicans H.. capsulatum colonizza macrofagi alveolari replicando all'interno del phagosome macrofagi, e qui, abbiamo quantitativamente valutare la crescita di H. lieviti capsulatum in macrofagi RAW 264.7 con arancio di acridina / ioduro di propidio colorazione in combinazione con citometria immagine. Il nostro metodo fedelmente ricapitola i trend di crescita, misurata dalla colonia tradizionale formando unità di enumerazione, ma di un significativo aumento della sensibilità. Inoltre, valutiamo direttamente infezione di macrofagi in diretta con un ceppo GFP che esprimono di C. albicans. La nostra metodologia offre un mezzo rapido, preciso ed economico per il rilevamento e la quantificazione di importanti funghi patogeni umani in associazione spiritocellule ospiti h.
Introduzione
Studi di funghi patogeni, in associazione con i loro ospiti e / o le cellule ospiti richiedono spesso quantificazione delle cellule fungine vitali corso di un corso di tempo o in diverse condizioni di infezione. Enumerazione di unità formanti colonie (CFU) è il metodo standard con cui è stato misurato il numero di cellule vitali fungine, tuttavia, questa tecnica presenta diversi inconvenienti e limitazioni. In primo luogo, molte specie fungine sono a crescita lenta. La crescita di colonie visibili su terreni solidi può richiedere 1-2 settimane, rallentando notevolmente il ritmo della ricerca. Secondo, manipolazione dei campioni durante CFU placcatura è un processo la....
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Protocollo
1. L'infezione dei macrofagi con H. capsulatum, C. albicans
- 16 ore prima dell'infezione, macrofagi sementi alla densità desiderata in piastre da 24 pozzetti. In questo protocollo, è stata utilizzata una densità di 3,0 x 10 5 cellule / pozzetto.
- Aggiungi cellule fungine in fase di crescita logaritmica ad una molteplicità desiderato di infezione (MOI). Questo protocollo può accogliere una gamma di MOI (0,2-5,0). Per l'infezione di macrofagi RAW264.7 con H. capsulatum, abbiamo utilizzato un MOI di 0,2.
- Seguendo 1,5 ore per permettere la fagocitosi, i macrofagi lavare tre volte con PBS per rimuovere ....
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Risultati
Abbiamo usato il Cellometer Vision immagine citometro a monitorare la crescita di H. capsulatum in macrofagi. 264.7 cellule RAW sono state infettate con H. cellule di lievito capsulatum e in vari momenti, i campioni sono stati sottoposti ad AO / PI colorazione seguita da analisi di citometria basata sulle immagini. In parallelo, i campioni sono stati analizzati con tradizionale enumerazione CFU. Ad ogni tempo, i campioni sono stati incubati in acqua per lisare macrofagi e le cellule di lievito.......
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Discussione
Citometria a immagine consente di catturare immagini di alta qualità e, utilizzando software specializzati, eseguire una rapida quantificazione delle cellule. Una sfida potenziale all'adozione di citometria immagine nel campo della patogenesi microbica è che sono presenti in una popolazione mista di cellule, comprese le cellule ospiti di mammifero i microbi da contare. Qui, dimostriamo che citometria immagine può essere utilizzato per la quantificazione dei lieviti patogeni vitali durante l'infezione in vitr.......
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Dichiarazioni
Gli autori Leo Li-Ying Chan e Benjamin Paradis sono dipendenti di Nexcelom Bioscience LLC.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Siero fetale bovino | Life Technologies | 16000044 | |
| Soluzione AO/PI | Nexcelom Bioscience | CSK-0102 | |
| Camera di conteggio monouso | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| < strong>EQUIPMENT | |||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | ||
| Software di visione per cellometro | Nexcelom Bioscience |
Riferimenti
- Worsham, P. L., Goldman, W. E. Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores. J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).
- Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J.
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Ristampe e permessi
