Anche se il sistema nervoso periferico (PNS) è in grado di riparare significativo dopo l'infortunio, poco si sa circa i meccanismi cellulari e molecolari che regolano questo fenomeno. Utilizzando vivo, zebrafish transgenico e riproducibile saggio resezione del nervo, siamo in grado di studiare i comportamenti delle cellule gliali dinamici durante la degenerazione dei nervi e la rigenerazione.
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Articolo metodologico
Motor Nerve transezione e Time-lapse imaging di gliali comportamenti delle cellule in vivo Zebrafish
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il sistema nervoso è spesso descritto come componente hard-wired del corpo, anche se si tratta di un sistema di organi considerevolmente fluido che reagisce a stimoli esterni in maniera stereotipata coerente, pur mantenendo un'incredibile flessibilità e plasticità. A differenza del sistema nervoso centrale (SNC), il sistema nervoso periferico (PNS) è in grado di riparare significativa, ma abbiamo appena iniziato a comprendere i meccanismi cellulari e molecolari che regolano questo fenomeno. Utilizzando zebrafish come sistema modello, abbiamo l'opportunità senza precedenti di studi rigenerativi coppia con l'imaging in vivo e di manipolazione genetica. Nervi periferici sono composti di assoni circondati da strati di cellule gliali e tessuto connettivo. Gli assoni sono ensheathed da mielinizzanti o non mielinizzanti cellule di Schwann, che sono a loro volta avvolto in un fascicolo da una guaina cellulare chiamato il perinevrio. A seguito di un infortunio, nervi periferici adulti hanno la straordinaria capacità di remove danneggiato detriti assonale e obiettivi re-innervano. Per studiare i ruoli di tutti glia periferica in PNS rigenerazione, descriviamo qui un saggio transection assone che utilizza un laser a colorante disponibile in commercio azoto pompato a axotomize nervi motori in vivo zebrafish transgenico. Approfondiremo i metodi di accoppiare questi esperimenti di time-lapse imaging di nervi feriti e di controllo. Questo paradigma sperimentale può essere utilizzato non solo per valutare il ruolo che giocano glia in rigenerazione nervosa, ma può anche essere la piattaforma per chiarire i meccanismi molecolari che governano riparazione del sistema nervoso.
Introduzione
Zebrafish sono stati ampiamente utilizzati per studiare sviluppo del sistema nervoso a causa della loro trasparenza ottica e facilità di transgenesi, che, se accoppiato, permettere spettacolare imaging comportamenti delle cellule dinamiche in un embrione vivente. Inoltre, poiché zebrafish e mammiferi condividono quasi tutti i geni necessari per la formazione del sistema nervoso, informazione cellulare e molecolare raccolte in questo organismo modello è direttamente riferibile ad altre specie di vertebrati. Anche se incredibilmente potente per gli studi sullo sviluppo neurale, il pesce zebra ed i suoi attributi unici hanno il potenziale per chiarire anche i meccanismi....
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Protocollo
1. Preparazione e montaggio di embrioni di zebrafish per l'ablazione e vivo Imaging
- Preparare uno stock di 0,8% basso punto di fusione agarosio in acqua uovo. Aliquota in 13X 100 millimetri tubi cultura usa e getta e conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
- Croce zebrafish adulto contenenti transgeni integrati stabilmente per etichettare fluorescenti i neuroni motori e tipi di cellule gliali di interesse. Raccogliere embrioni di zebrafish in acqua uovo e mettere in 28,5 ° C incubatore per la corretta messa in scena più tardi 3.
- A circa 24 ore dopo la fecondazione (HPF), rimuovere l'acqua uovo e aggiungere 0,00....
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Risultati
Il saggio descritto qui può essere utilizzato per valutare la risposta delle cellule gliali e altre popolazioni di cellule nervose associate al danno assonale in vivo. Filmato 1 mostra un esempio di una lesione del nervo creato con questo metodo e la risposta delle cellule gliali circostanti. Questo esperimento è stato eseguito in Tg (nkx2.2a: megfp); Tg (Olig2: DsRed) zebrafish, in cui glia perineurale esprimono una membrana mirata EGFP e motore neuroni esprimono citosolico DsRed. Il .......
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Discussione
Le fasi più critiche di questo disegno sperimentale sono: 1) correttamente larve montaggio per lesioni e successive imaging in vivo e 2) calibrare il laser e selezionando le impostazioni di alimentazione corrette per poter creare una transezione del nervo pulita che provoca danni extra-tessuto minimal . Per contribuire a garantire un assotomia successo per l'imaging in vivo e successiva analisi, montare larve multiplo in entrambi i singoli piatti con fondo di vetro o in un piatto fondo di vetro con.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il Lab Kucenas per preziosi discussioni e Quorum Technologies, Inc. per il superbo supporto tecnico. Il lavoro è stato sostenuto dal Fondo UVa per l'eccellenza nella scienza e la tecnologia (FEST) (SK).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Phenylthiourea | Sigma | P7629-100G | |
| Finquel Tricaina Metansolfonato MS-222 | Argent Chemical | C-FINQ-UE-100G | |
| Agarosio a basso punto di fusione | Sigma | A9414-10G | |
| Quad CELLview Piastre per colture cellulari, fondo di vetro, sterile, Greiner Bio One | VWR/Greiner | 89125-444 | |
| Piastre di Petri con fondo in vetro a pozzetto singolo 35 x 10 mm, spessore 12 mm | Willco Wells | GWSt-3512 | |
| MicroPoint Laser System con tutti i componenti | Andor Technology - acquistato tramite Quorum Technologies, Inc. | 2203-SYS | |
| Laser MicroPoint Colorante Courmarin (435 nm) | Andor Technology | MP-27-435-DYE |
Riferimenti
- Geuna, S., et al. Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).
- Hirata, K., Kawabuchi, M. Myelin phagocytosis by macrophages and no....
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Ristampe e permessi
