Un protocollo per induzione genetica e la visualizzazione dei tumori benigni e invasive in cefalico Complessi di Drosophila melanogaster

Sommario

La cooperazione tra l'oncogene attivato, come RAS ^V12 e le mutazioni nei geni della polarità cellulare come scarabocchiato, causare la crescita del tumore in Drosophila in cui le cellule tumorali mostrano anche comportamenti invasivi. Qui un semplice protocollo per l'induzione e l'osservazione dei tumori benigni e invasivi è presentato.

Abstract

Drosophila ha illuminato la nostra comprensione della base genetica dello sviluppo normale e malattia negli ultimi decenni e oggi si continua a contribuire enormemente alla nostra comprensione di malattie complesse ^1-7. Progressione dei tumori da un benigno ad uno stato metastatico è un evento complesso ⁸ ed è stato modellato in Drosophila per aiutarci a capire meglio la base genetica di questa malattia ^9. Qui vi presento un semplice protocollo per indurre geneticamente, osservare e quindi analizzare la progressione dei tumori in Drosophila larve. La tecnica di induzione tumorale si basa sul sistema marcm ¹⁰ e sfrutta la cooperazione tra un oncogene attivato, Ras ^V12 e perdita di geni polarità cellulare (intima, dischi grandi e letale larve gigante) per generare tumori invasivi ^9. I dimostrare come questi tumori possono essere visualizzati nelle larve intatto epoi come queste possono essere sezionati per ulteriori analisi. Il protocollo semplificato qui presentato dovrebbe consentire di questa tecnica per essere utilizzato da ricercatori interessati a comprendere il ruolo di un gene in invasione tumorale.

Introduzione

Progressione dei tumori da un benigno ad uno stato metastatico è un processo passo saggio che si caratterizza per l'evasione di meccanismi protettivi presenti nel corpo ^8. Per esempio le cellule tumorali nel corpo deve essere in grado di eludere l'apoptosi e il sistema immunitario, sfondamento della matrice extracellulare specializzata (ECM) chiamato membrana basale, e superare eventuali controlli sociali imposti dalle cellule circostanti ^8. E 'attraverso un saggio passo progressione che le cellule tumorali acquisiscono la capacità di migrare e colonizzare siti distanti in un processo chiamato metastasi. La nostra comprensione di come la cellula tumorale supera le barriere imposte dal corpo è ancora nella sua infanzia, tuttavia, il quadro che emerge dalla ricerca effettuata punti sinora per un uso ripetuto di processi di sviluppo normali e vie di segnalazione da parte delle cellule tumorali ^11-13.

La mosca della frutta Drosophila melanogaster ha contribuito enormemente alla nostra understanding del normale sviluppo e della malattia attraverso l'uso di sofisticate tecniche genetiche sviluppate nel corso degli ultimi decenni ^14-17. Utilizzo di mutagenesi e gli strumenti iperespressione siamo arrivati ​​ad una migliore comprensione dei diversi oncogeni e geni oncosoppressori ^18-22. Tuttavia, la metastasi del tumore è il risultato della cooperazione tra diverse lesioni genetiche che è stato studiato principalmente in modelli di coltura cellulare ^23,24 così come i vari modelli di xenotrapianto ^25-27. Questi modelli però potente presentano dei limiti per quanto non simulare perfettamente le condizioni trovate in un organismo vivente. Inoltre, i modelli transgenici disponibili nei topi sono ingombranti e non favorevole alla analisi genetica del comportamento invasivo ^28,29. Diversi studi hanno cercato di capire invasione delle cellule tumorali in Drosophila ^30,31. Queste tecniche utilizzano principalmente trapianto di tumori primari agli host e poi si basano sul monitoraggio del TRAI tumori nsplanted per l'invasione dei tessuti circostanti ^32,33. Una tecnica potente chiamato marcm ¹⁰ è stato adattato da Pagliarini e Xu modellare l'invasione del tumore in Drosophila ^9. Questa elegante modellazione genetica di invasione tumorale sfruttata la cooperazione tra un oncogene attivato e la perdita della polarità cellulare. La potenza di questa modellazione sta nel fatto che i tumori invasivi sono creati in un organismo intatto eludendo così la necessità di trapianti di tessuti. Per realizzare la cooperazione oncogeno, un oncogene attivato come Ras ^V12 è espresso in cloni di cellule nel disco occhio-antenne larvale. Come risultato della tecnica marcm questi cloni sono contrassegnati con proteina fluorescente verde (GFP) per una facile visualizzazione e sono fatti mutanti omozigoti per polarità cellulare come letale larve gigante, intima, e dischi grandi. Il risultato è GFP etichettato tumori invasivi nella complesso cefalica. In questa relazione hodimostrare come indurre, e visualizzare questi tumori invasivi sia nel contesto di un larve intatta e sezionato fuori complesso cefalica. L'induzione del tumore qui presentato utilizza reagenti sul secondo cromosoma di Drosophila. Nella Tabella 2, fornisco una lista di titoli su X e ³ ° cromosomi che possono essere utilizzati per lo stesso scopo. Credo che questo protocollo semplificato renderà questa tecnica facilmente accessibile ai ricercatori interessati a comprendere le basi molecolari della progressione tumorale.

Protocollo

1. L'induzione di tumori benigni non invasivi

1. Utilizzare titoli elencati nella tabella 2 per l'induzione di tumori benigni.
2. Preparare una coltura starter per lo stock "tester" del seguente genotipo: y, w, ey-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A; Act5C> y +> GAL4, UAS-GFP
3. Preparare una coltura starter per lo stock "testata" del seguente genotipo: w; FRT40A, UAS-Ras ^V12 / CYO
4. Raccogliere dieci vergini femminile dal titolo "tester" e dieci maschi dalla "testata" magazzino.
5. Attraversare i maschi e le femmine del "tester" e "controllati" magazzino inserendoli entrambi in un flaconcino con la mosca cibo.
6. Mettere la croce in un incubatore a 25 ° C e permettono ai maschi e femmine si accoppiano e depongono le uova per 24-48 ore.
7. Controllare le fiale per sufficiente la deposizione delle uova e per la presenza di larve di prima instar fare in modo che la cultura non si asciuga fuori.
   1. Aggiungere qualche goccia di autoclaveacqua distillata alla cultura per mantenerlo umido (se la cultura sta asciugando out).
   2. Continuare a monitorare la cultura e ripetere il punto 1.7.1, se necessario.
8. Osservare errante terzo instar larve allo stereomicroscopio a fluorescenza, come indicato nella sezione 3.

2. L'induzione di tumori invasivi

1. Utilizzare titoli elencati nella tabella 2 per l'induzione di tumori invasivi.
2. Utilizzare la coltura starter dal punto 1.2 del seguente genotipo: y, w, ey-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A; Act5C> y +> GAL4, UAS-GFP
3. Preparare una coltura starter per lo stock "testata" del seguente genotipo: w; LGL ^4, FRT40A, UAS-Ras ^V12 / CYO
4. Raccogliere dieci vergini femminile dal titolo "tester" e dieci maschi dalla "testata" magazzino.
5. Attraversare i maschi e le femmine del "tester" e "controllati" magazzino inserendoli entrambi in un flaconcino con la mosca food.
6. Mettere la croce in un incubatore a 25 ° C e permettono ai maschi e femmine si accoppiano e depongono le uova per 24-48 ore.
7. Controllare le fiale per sufficiente la deposizione delle uova e per la presenza di larve di prima instar fare in modo che la cultura non si asciuga fuori.
   1. Aggiungere qualche goccia di acqua distillata autoclavato alla cultura per mantenerlo umido (se la cultura sta asciugando out).
   2. Continuare a monitorare la cultura per la secchezza e ripetere il punto 2.7.1, se necessario.
8. Osservare terzo instar larve allo stereomicroscopio a fluorescenza, come indicato nella sezione 3.

3. L'osservazione di tumori benigni e invasive

1. Utilizzare terzo instar larve per l'isolamento tumore benigno e visualizzazione.
   1. Bagnare un pennello in acqua distillata, e utilizzando questo pennello raschiare alcune larve al terzo stadio dalla parete del flaconcino cultura.
   2. Mettere larve in una diapositiva depressione con PBS 1X e poi con un pennello bagnato rottamiposta fuori qualsiasi materiale alimentare dall'epidermide larvali.
   3. Porre le larve in una piastra Petri e lasciare a -20 ° C per 30 min freezer per immobilizzare la larva.
      1. Metodo alternativo per immobilizzare le larve utilizzando FLYNAP.
      2. Posizionare una bacchetta FLYNAP immersa nel FLYNAP al flaconcino da 3.1.3.2 e dopo aver collegato il let flaconcino flaconcino collegato con larve riposare per 30-40 minuti.
   4. Posizionare la larva immobilizzato su un vetrino, aggiungere una goccia di olio halocarbon luce, coprire con un vetro di copertura e osservare allo stereomicroscopio a fluorescenza con la capacità di visualizzare Green Fluorescent Protein (GFP).
   5. Il tumore benigno cuscinetto larve fluorescenza verde nella regione anteriore dove il complesso cefalica è presente.
2. Selezionare il giorno 10 larve (dopo induzione), dalla cultura impostato al punto # 2 per l'osservazione dei tumori invasivi. Giorno 10 larve sono selezionati perché le larve cuscinetto tumore invasivo hanno un l prolungatofase Arval e generalmente non riescono a pupariate.
3. Seguire i passaggi da 3.1.1 a 3.1.4 tranne che invece di terzo instar uso larve giorno 10 larve.
   1. Il giorno 10 cuscinetto tumore invasivo larve fluorescenza verde nella regione anteriore dove il complesso cefalica è presente.
4. Se il microscopio fluorescente è dotato di una fotocamera digitale poi fotografare la fluorescenza larve benigno e tumore invasivo cuscinetto.

4. La dissezione della osservazione cefalico Complex e ulteriore di tumori benigni e invasive

L'epidermide traslucide del larva rende difficile osservare il grado di invasione di tumori. Così l'estensione dell'invasione è meglio visualizzata sezionando il complesso cefalica fuori della larva. I seguenti passaggi devono essere utilizzati per sezionare il complesso cefalica.

1. Utilizzando un pennello bagnato per selezionare le larve terzo instar (per i tumori benigni) e il giorno 10 larve (per i tumori invasivi) fROM rispettivi flaconi di coltura.
2. Mettere larve in un pozzo di un piatto contenente dissezione a freddo PBS 1X. Usa il pennello per togliere eventuali residui di cibo dai epidermide larvali.
   1. Trasferimento larve pulito per un nuovo bene del piatto dissezione contenente freddo PBS 1X.
   2. Verificare la presenza di GFP fluorescenza utilizzando uno stereomicroscopio in grado di rilevare la fluorescenza. Scartare non-GFP larve cuscinetto.
3. Aggiungere 1,0 ml di PBS 1X freddo per un pozzo fresco sul piatto dissezione e utilizzando un paio di pinze trasferire una larva cuscinetto sia i tumori benigni o invasivi (il protocollo dissezione rimane la stessa per i due tipi di tumori).
4. Tenere la larva verso il basso con un paio di pinze circa 2/3rds dalla fine anteriore.
   1. Utilizzare l'altra coppia di pinze ed elegantemente separare il 1/3rd posteriore della larva e scartarla.
   2. Lasciate andare anteriore 2/3rds della larva. Quando la pressione all'interno della larva viene rilasciato il contenuto dellarva permette la fuoriuscita della cavità del corpo.
   3. Utilizzare un paio di pinze per rimuovere l'intestino, grasso corporeo e altri contenuti interni della larva che hanno colava fuori della cavità del corpo.
   4. Utilizzare un paio di pinze per tenere il gancio bocca del larva e spingerlo nell'epidermide larvali e con l'altra coppia di pinze invertire completamente la larva.
   5. Utilizzare le pinze per rimuovere delicatamente e accuratamente il corpo grasso, ghiandole salivari, intestino, il complesso disco ala ed eventuali tubi tracheali. Il complesso cefalica dovrebbe essere visibile attaccato al gancio bocca della larva invertita. Gli emisferi cerebrali e il cordone nervoso ventrale (VNC) sarebbe ancora essere collegati l'epidermide larvali attraverso i nervi provenienti dalla VNC.
   6. Utilizzare un paio di pinze per rompere delicatamente le connessioni tra i nervi cefaliche e l'epidermide larvali.
   7. Poiché le connessioni nervose tra il VNC e l'epidermide larvali sono rotti e grasso corporeo in eccesso e altri tessuti rimossi, il co cefalicamplex diventerebbe chiaramente visibili e saranno allegate alla epidermide larvali solo presso i ganci bocca.
   8. Il complesso cefalica può essere lasciato collegato alla epidermide larvali se il complesso deve essere fissato per applicazioni a valle come colorazione anticorpale o per la visualizzazione successiva.
   9. Se non altre applicazioni a valle verrebbe eseguita allora il complesso cefalica può essere staccato dall'epidermide larvali e posta in una goccia di un mezzo di montaggio glicerolo base per ulteriore osservazione e di analisi. Utilizzare Vectashield come il mezzo di montaggio.

Risultati

Come risultato del protocollo presentato qui l'utente sarà in grado di indurre tumori benigni sovraesprimendo un oncogene attivato nel larvale occhio antennal disco immaginale. L'utente sarà anche in grado di indurre tumori invasivi nel disco antennal occhio sovraesprimendo un oncogene attivato al cloni di cellule mutanti anche per un gene polarità cellulare. I tumori possono essere facilmente visualizzati con l'aiuto di uno stereomicroscopio a fluorescenza come tessuto "fluorescente verde" in tutto larve o in complessi...

Discussione

Il cancro è una malattia complessa con una comprensione molto migliore oggi rispetto al passato. Tuttavia, resta ancora molto da imparare e spiegato prima abbiamo un quadro completo dei meccanismi alla base. Il semplice protocollo qui presentato permette di indurre geneticamente tumori benigni e invasivi in ​​un intero organismo e poi studiare la biologia associata alla progressione dei tumori in questo modello. La maggior parte delle tecniche esistenti in Drosophila e altri organismi o utilizzano un sistema di...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10X PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) pH 7,2 soluzione madre	Invitrogen, Sigma Aldrich
Refrigerato 1X PBS pH7.2 soluzione di lavoro	Invitrogen, Sigma Aldrich		Preparare fresco e conservare in frigorifero, può essere utilizzato fino a una settimana
Flynap	Carolina Biologicals		Anestesia per mosche necessaria per anestetizzare le larve
Fissativo	0,1M PIPES, pH 7,2, 4% Paraformaldeide		Necessario per riparare il complesso cefalico sezionato
Ice Bucket Diverse			soluzioni di manutenzione sul ghiaccio. Inoltre, sezionare il complesso cefalico in 1X PBS refrigerato e quindi metterlo su ghiaccio in una provetta Eppendorf
da 1,7 ml Eppendorf tube	Vari
vetrini in vetro, vetro di copertura	Fisher Scientific
Vectashield Mounting Media o qualsiasi altro mezzo di montaggio	Vector Laboratories
Halocarbon 200 o 700 Oil	Polysciences Inc. o Halocarbon.com		L'alocarbonio 200 viene utilizzato per montare le larve per la visualizzazione su uno stereoscopio a fluorescenza
Sally Hansen Smalto per unghie "Hard as Nails"	Può essere trovato in qualsiasi negozio		Necessario per sigillare i bordi del vetrino coprioggetti
Uno stereomicroscopio a fluorescenza Leica MZ16.5 o qualsiasi altro stereomicroscopio a fluorescenza	Leica e altri		Necessario per osservare la fluorescenza GFP nelle larve
Pinze Dumont #5	Fine Science Tools
Pyrex 9 pozzetti spot plate o qualsiasi altro piatto di dissezione	Pennello Sigma Aldrich
	Può essere trovato in qualsiasi negozio
Tabella 1. Materiali necessari per eseguire il protocollo sperimentale presentato in questo articolo.