La cooperazione tra l'oncogene attivato, come RAS V12 e le mutazioni nei geni della polarità cellulare come scarabocchiato, causare la crescita del tumore in Drosophila in cui le cellule tumorali mostrano anche comportamenti invasivi. Qui un semplice protocollo per l'induzione e l'osservazione dei tumori benigni e invasivi è presentato.
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Articolo metodologico
Un protocollo per induzione genetica e la visualizzazione dei tumori benigni e invasive in cefalico Complessi di
In questo articolo
Sommario
Abstract
Drosophila ha illuminato la nostra comprensione della base genetica dello sviluppo normale e malattia negli ultimi decenni e oggi si continua a contribuire enormemente alla nostra comprensione di malattie complesse 1-7. Progressione dei tumori da un benigno ad uno stato metastatico è un evento complesso 8 ed è stato modellato in Drosophila per aiutarci a capire meglio la base genetica di questa malattia 9. Qui vi presento un semplice protocollo per indurre geneticamente, osservare e quindi analizzare la progressione dei tumori in Drosophila larve. La tecnica di induzione tumorale si basa sul sistema marcm 10 e sfrutta la cooperazione tra un oncogene attivato, Ras V12 e perdita di geni polarità cellulare (intima, dischi grandi e letale larve gigante) per generare tumori invasivi 9. I dimostrare come questi tumori possono essere visualizzati nelle larve intatto epoi come queste possono essere sezionati per ulteriori analisi. Il protocollo semplificato qui presentato dovrebbe consentire di questa tecnica per essere utilizzato da ricercatori interessati a comprendere il ruolo di un gene in invasione tumorale.
Introduzione
Progressione dei tumori da un benigno ad uno stato metastatico è un processo passo saggio che si caratterizza per l'evasione di meccanismi protettivi presenti nel corpo 8. Per esempio le cellule tumorali nel corpo deve essere in grado di eludere l'apoptosi e il sistema immunitario, sfondamento della matrice extracellulare specializzata (ECM) chiamato membrana basale, e superare eventuali controlli sociali imposti dalle cellule circostanti 8. E 'attraverso un saggio passo progressione che le cellule tumorali acquisiscono la capacità di migrare e colonizzare siti distanti in un processo chiamato metastasi. La nostra comprensione di com....
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Protocollo
1. L'induzione di tumori benigni non invasivi
- Utilizzare titoli elencati nella tabella 2 per l'induzione di tumori benigni.
- Preparare una coltura starter per lo stock "tester" del seguente genotipo: y, w, ey-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A; Act5C> y +> GAL4, UAS-GFP
- Preparare una coltura starter per lo stock "testata" del seguente genotipo: w; FRT40A, UAS-Ras V12 / CYO
- Raccogliere dieci vergini femminile dal titolo "tester" e dieci maschi dalla "testata" magazzino.
- Attraversare i maschi e le femmine del "tester" e "controllati" magazzino inserendoli entr....
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Risultati
Come risultato del protocollo presentato qui l'utente sarà in grado di indurre tumori benigni sovraesprimendo un oncogene attivato nel larvale occhio antennal disco immaginale. L'utente sarà anche in grado di indurre tumori invasivi nel disco antennal occhio sovraesprimendo un oncogene attivato al cloni di cellule mutanti anche per un gene polarità cellulare. I tumori possono essere facilmente visualizzati con l'aiuto di uno stereomicroscopio a fluorescenza come tessuto "fluorescente verde" in tutt.......
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Discussione
Il cancro è una malattia complessa con una comprensione molto migliore oggi rispetto al passato. Tuttavia, resta ancora molto da imparare e spiegato prima abbiamo un quadro completo dei meccanismi alla base. Il semplice protocollo qui presentato permette di indurre geneticamente tumori benigni e invasivi in un intero organismo e poi studiare la biologia associata alla progressione dei tumori in questo modello. La maggior parte delle tecniche esistenti in Drosophila e altri organismi o utilizzano un sistema di.......
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Dichiarazioni
Non ho nulla da rivelare.
Ringraziamenti
La ricerca nel mio laboratorio è sostenuto dal Dipartimento WKU dei fondi di avvio Biologia, WKU Research Foundation RCAP-I concedere # 11-8032 e da una sovvenzione KBRIN-AREA finanziata attraverso una sovvenzione genitore dall'Istituto Nazionale delle Scienze Mediche Generali degli Istituti Nazionali della Salute con il numero award 5P20GM103436-13. Vorrei inoltre ringraziare il dottor Tian Xu nel cui laboratorio sono stato presentato a questa tecnica e il dottor Raymond Pagliarini che per primo ha stabilito questa tecnica in laboratorio Xu.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10X PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) pH 7,2 soluzione madre | Invitrogen, Sigma Aldrich | ||
| Refrigerato 1X PBS pH7.2 soluzione di lavoro | Invitrogen, Sigma Aldrich | Preparare fresco e conservare in frigorifero, può essere utilizzato fino a una settimana | |
| Flynap | Carolina Biologicals | Anestesia per mosche necessaria per anestetizzare le larve | |
| Fissativo | 0,1M PIPES, pH 7,2, 4% Paraformaldeide | Necessario per riparare il complesso cefalico sezionato | |
| Ice Bucket Diverse | soluzioni di manutenzione sul ghiaccio. Inoltre, sezionare il complesso cefalico in 1X PBS refrigerato e quindi metterlo su ghiaccio in una provetta Eppendorf | ||
| da 1,7 ml Eppendorf tube | Vari | ||
| vetrini in vetro, vetro di copertura | Fisher Scientific | ||
| Vectashield Mounting Media o qualsiasi altro mezzo di montaggio | Vector Laboratories | ||
| Halocarbon 200 o 700 Oil | Polysciences Inc. o Halocarbon.com | L'alocarbonio 200 viene utilizzato per montare le larve per la visualizzazione su uno stereoscopio a fluorescenza | |
| Sally Hansen Smalto per unghie "Hard as Nails" | Può essere trovato in qualsiasi negozio | Necessario per sigillare i bordi del vetrino coprioggetti | |
| Uno stereomicroscopio a fluorescenza Leica MZ16.5 o qualsiasi altro stereomicroscopio a fluorescenza | Leica e altri | Necessario per osservare la fluorescenza GFP nelle larve | |
| Pinze Dumont #5 | Fine Science Tools | ||
| Pyrex 9 pozzetti spot plate o qualsiasi altro piatto di dissezione | Pennello Sigma Aldrich | ||
| Può essere trovato in qualsiasi negozio | |||
| Tabella 1. Materiali necessari per eseguire il protocollo sperimentale presentato in questo articolo. | |||
Riferimenti
- Bale, A. E. Hedgehog signaling and human disease. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 47-65 (2002).
- Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
- Coombs, G. S., Covey, T. M., Virshup, D. M.
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Ristampe e permessi
