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Articolo metodologico

La stampa termosensibile Stampi inversa per la Creazione di Patterned idrogeli a due componenti per coltura cellulare 3D

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DOI:

10.3791/50632

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10 luglio 2013

 ,  ,  , 
1Department of Health Science & Technology, Cartilage Engineering & Regeneration, 2Biomaterials Department, Innovent e.V.

In questo articolo

Sommario

Un bioprinter stato usato per creare idrogel patterned basato su uno stampo sacrificale. Lo stampo poloxamer stata riempita con un secondo idrogel e quindi eluita, lasciare vuoti che sono stati riempiti con una terza idrogel. Questo metodo utilizza eluizione veloce e buona stampabilità di polossalene di generare architetture complesse di biopolimeri.

Abstract

Bioprinting è una tecnologia emergente che ha le sue origini nel settore della prototipazione rapida. I diversi processi di stampa possono essere suddivisi in contatto bioprinting 1-4 (estrusione, dip penna e litografia soft), contactless bioprinting 5-7 (transfer laser in avanti, stampa a getto di deposizione) e tecniche basate laser come due fotoni fotopolimerizzazione 8. Può essere usato per molte applicazioni come ingegneria dei tessuti 9-13, 14-16 microfabbricazione biosensore e come strumento per rispondere a domande biologiche di base come influenze di co-coltura di tipi cellulari 17. A differenza dei metodi fotolitografiche o soft-litografica comuni, estrusione bioprinting ha il vantaggio che non richiede una maschera o timbro separato. Utilizzando il software CAD, la progettazione della struttura può essere rapidamente modificato e adeguato in funzione delle esigenze dell'operatore. Questo rende più flessibile che bioprinting litografia basataapprocci.

Qui mostriamo la stampa di uno stampo sacrificale per creare una struttura multi-materiale 3D utilizzando una matrice di colonne all'interno di un idrogel come esempio. Questi pilastri potrebbero rappresentare strutture cave per una rete vascolare o dei tubi all'interno di un condotto guida nervosa. Il materiale scelto per lo stampo sacrificale era polossamero 407, un polimero termosensibile con eccellenti proprietà di stampa che è liquido a 4 ° C e un solido sopra della sua temperatura di gelificazione ~ 20 ° C per 24,5% w / v soluzioni 18. Questa proprietà permette lo stampo sacrificale polossamero basata da eluito su richiesta e presenta vantaggi rispetto alla lenta dissoluzione di un materiale solido soprattutto per geometrie strette. Poloxamer è stato stampato su vetrini da microscopio per creare lo stampo sacrificale. Agarosio è stato pipettato nello stampo e raffreddato fino a gelificazione. Dopo l'eluizione del poloxamer in acqua ghiacciata, i vuoti nello stampo agarosio sono stati riempiti con alginato metacrilato spIked con FITC fibrinogeno marcato. I vuoti riempiti sono stati poi reticolato con raggi UV e il costrutto è stato ripreso con un microscopio a fluorescenza.

Introduzione

Approcci di ingegneria tissutale hanno fatto molti progressi negli ultimi anni per quanto riguarda la rigenerazione di tessuti e organi umani 19,20. Tuttavia, finora, l'attenzione di ingegneria tissutale è stata spesso limitata ai tessuti che hanno una struttura semplice o piccole dimensioni come la vescica 21,22 o la pelle 23-25. Il corpo umano, tuttavia, contiene molti complessi tessuti tridimensionali in cui le cellule e matrice extracellulare sono disposte in modo spazialmente definito. Di produrre questi tessuti, è richiesta una tecnica che può collocare cellule e matrice extracellulare ponteggi all'interno di un costrutto tridimensionale in posizioni specificate. Bioprinting ha il potenziale di essere un tale tecnica in cui la visione di produzione complessi tessuti tridimensionali può essere realizzato 10,11,26-28.

Bioprinting è definito come "l'uso di processi di trasferimento di materiale per patterning e montaggio biologicamente relmateriali nenti - molecole, cellule, tessuti e di biomateriali biodegradabili. - con una organizzazione prescritto di realizzare una o più funzioni biologiche "4 Si comprende diverse tecniche che funzionano a diverse risoluzioni e le scale di lunghezza, che vanno dalla risoluzione sub-micron di due -fotone polimerizzazione 29 ad una risoluzione di 150 micron a 420 micron per la stampa estrusione 1,12,30. Non un unico materiale o combinazione di materiali in grado di soddisfare le esigenze di ciascun metodo 31. Per la stampa di estrusione, i parametri chiave sono viscosità e tempo di gelificazione 32, dove l'alta viscosità e rapido gelificazione sono desiderabili.

Stampa 3D è una tecnica che permette la facile creazione di stampi sacrificali per la creazione di geometrie complesse 30,33,34. Questo processo si basa sulla realizzazione di uno stampo utilizzando una tecnica di prototipazione rapida, come un bioprinter estrusione. Lo stampo sacrificale creata viene utilizzataper formare strutture complesse da materiali che sono difficili da stampare a causa della loro bassa viscosità e tempo di gelificazione lento. Il metodo qui presentato prevede la realizzazione di uno stampo sacrificale costituito da un materiale che si dissolve rapidamente a bassa temperatura e può essere estrusa con precisione. Il copolimero a blocchi poli (etilene glicole) 99-poli (propilene glicole) 67-poli (glicole etilenico) 99 (noto anche come Pluronic F127 o poloxamer 407) soddisfa questi requisiti. Esso è già stato usato in una versione modificata nella stampa estrusione 1 ma, a nostra conoscenza, non è mai stata utilizzata per la stampa nella sua versione non modificata a causa della sua instabilità in ambienti liquidi. Polossamero 407 mostra anche un inverso termico comportamento reattivo 18, vale a dire che cambia da un gel ad un sol sul raffreddamento. La cosa più importante, può essere stampato in complesse strutture arbitrariamente curve ad altissima fedeltà. Ciò permette la creazione di un idrogel strutturata da unamateriale a bassa viscosità, in questo caso lento gelificazione agarosio, pipettando la soluzione nello stampo sacrificale stampato. La combinazione di stampa stampo sacrificale con alta fedeltà e l'eluizione rapida dall'idrogel strutturato colato rende un metodo veloce e flessibile per creare stampi con geometrie diverse, senza l'uso di una maschera o un timbro come è spesso richiesto in metodi litografici. L'idrogel strutturato colato può essere ulteriormente riempito con un altro materiale che non è adatto per la stampa estrusione a causa della sua bassa viscosità. Questo è nel nostro caso una soluzione di alginato metacrilato bassa viscosità. Qui vi presentiamo il metodo di termosensibile stampi sacrificali inversa per idrogel patterning con l'esempio di una matrice colonna.

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Protocollo

1. Preparazione della Soluzione Poloxamer 407

Se disponibile, eseguire la preparazione della soluzione polossalene in una camera fredda (4 ° C). Se non disponibile, posizionare una bottiglia di vetro in un bicchiere pieno di acqua ghiacciata. A temperature più alte la polossamero sarà superiore al punto di gel e non sciogliere correttamente.

  1. Aggiungere 60 ml di soluzione di PBS freddo ghiaccio in una bottiglia di vetro e agitare energicamente con un agitatore magnetico.
  2. Pesare 24,5 grammi di polossamero e aggiungerlo in piccole quantità per la PBS freddo. Attendere che il polossamero ha parzialmente sciolto prima di aggiungere di più.
  3. Agitare la soluzione fino a quando tutti polossamero è sciolta.
  4. Aggiungere PBS freddo fino a raggiungere un volume finale di 100 ml. La concentrazione finale sarà 24,5% w / v
  5. Smettere di mescolare la soluzione e lasciare riposare a 4 ° C fino a quando bolle e schiuma nella soluzione sono scomparsi. Bolle che sono intrappolati all'interno del gel saranno trasferiti al pcartuccia rinter e porterà a difetti di stampi sacrificali stampati.
  6. Filtro (filtro 0,22 micron) la soluzione direttamente nella cartuccia di stampa per rimuovere eventuali particelle indesiderate che potrebbero intasare l'ago. La fase di filtraggio deve essere eseguita in una camera fredda (o se non disponibile con punte raffreddati filtro, ecc) per evitare gelificazione del polossalene nel filtro. Mantenere la cartuccia caricata a 4 ° C fino al 30 min prima dell'esperimento.

2. Preparazione della stampante 3D

La stampante 3D utilizzata in questo lavoro è stata la "biofabbrica" ​​dal regenHU. La parte estrusione del sistema costituito da più parti. Una cartuccia in pressione nella parte superiore è collegata a un connettore tramite un adattatore luer-lock. Il connettore colma gli spazi tra l'uscita della cartuccia e l'ingresso di una elettrovalvola. All'uscita dell'elettrovalvola, possono essere usati aghi con diametri diversi. Il materiale viene estruso su un substrare che ha luogo ad una fase in movimento mediante aspirazione. Le parti principali del sistema sono descritte nella Figura 1. Altri sistemi basati estrusione possono essere utilizzati per il processo di stampa, e il processo di ottimizzazione deve essere fatto per ogni sistema.

  1. Posizionare la valvola a solenoide (diametro ugello 0,3 mm) e l'ago (diametro interno 0,15 millimetri) in distinte da 1,5 ml provette riempiti con acqua ultrapura e metterli in un bagno ad ultrasuoni riscaldato da pulire per 30 min. Sciacquare le valvole puliti con etanolo e asciugare con una pistola di azoto.
  2. Installare la valvola e l'ago nella stampante e un, pulito cartuccia vuota.
  3. Applicare 3 bar di pressione al sistema e soffiare residui liquidi dalla valvola installato e ago con aria compressa. Per piccoli diametri ago, è consigliabile avere un filtro (filtro a siringa comune, 0,45 micron dimensione dei pori) installato all'uscita dell'aria compressa per evitare l'entrata di piccole particelle che potrebbero intasare l'ago.
  4. Girare la pressione e installare la cartuccia caricata con il polossamero. La cartuccia deve essere tolta dal frigorifero circa 30 minuti prima di montare la cartuccia in modo che il polossamero possa raggiungere temperatura ambiente e gel.
  5. Applicare pressione di 3 bar al sistema ed erogare polossamero fino a raggiungere la punta dell'ago e viene estruso in un filamento continuo.

3. Ottimizzazione dei parametri di stampa

Creare strutture 3D precisi, il processo di stampa deve essere ottimizzato per il materiale e la concentrazione scelta. Seconda della viscosità e il sistema di stampa 3D ogni materiale produrrà un volume di erogazione specifica e spessore linea per un insieme fisso di parametri.

  1. Con un software CAD adeguato (in grado di creare file ISO dai disegni), tracciare una riga circa la stessa lunghezza della struttura che si intende stampare.
  2. Posizionare un microscopio vetrino 25 millimetri x 75 mm x 1mm o qualsiasi altro substrato nella stampante e fissarlo ruotando sul vuoto.
  3. Nel software della stampante, impostare l'elettrovalvola ad un'elevata frequenza di 50 Hz e impostare una elevata pressione di 3 bar.
  4. Stampare uno strato di un'unica linea con una velocità di fase di 300 mm / min.
  5. Ridurre la pressione fino a raggiungere la larghezza linea desiderata. È inoltre possibile controllare il volume che viene estruso attraverso il tempo di apertura della valvola.
  6. Ridurre la frequenza della valvola fino nessuna linea continua può essere stampato più. Scegliere una frequenza di sopra di questo valore.

Nota: Una volta che la larghezza della linea desiderata e linee continue sono raggiunti, determinare la velocità di fase ottimale e spessore di strato cioè il sollevamento dell'ago dopo che uno strato stampato.

  1. Stampare più strati su uno sopra l'altro e vedere se l'ago è in giusta posizione sopra dello strato precedente dopo diversi strati stampati. Regolare lo spessore dello strato (ago ascensore) In modo che ogni strato è stampato sopra quello successivo (Figura 3).
  2. Diminuire la velocità di fase della tappa da 300 mm / min graduale in modo che gli strati estrusi iniziano e terminano alle stesse posizioni come i precedenti (Figura 4). Velocità troppo elevate causano palco sul palco per essere in movimento prima che il materiale estruso ha toccato il livello precedente.
  3. Per la stampa delle strutture pilastro seguono passi 3.1.-3.8., Ma invece di disegnare una sola linea disegnare un singolo punto. I parametri da fuoco quando la stampa dei pilastri sono la pressione (regola spessore e diametro pilastro di poloxamer), il tempo di apertura della valvola (volume estruso) e il tempo di residenza della testina di stampa nella posizione in cui il pilastro deve essere depositato .
  4. Quando i parametri sono ottimizzati, stampa diversi strati di una linea dovrebbe risultare in una parete solida, o in caso di punti, un pilastro. Salvare i parametri per un uso successivo.

4. Stampa ed eluizione dello stampo Reverse

Utilizzare i parametri rilevati durante la procedura di ottimizzazione da questo punto in poi.

  1. Stampare la struttura interna (qui si tratta di un array di pilastro) su un vetrino da microscopio e lasciare asciugare durante la notte. Questo a) riduce la dimensione e lo spessore delle strutture e b) fornisce una migliore aderenza tra la struttura ed il substrato, così lift-off durante il riempimento può essere evitato.
  2. Con il software CAD, disegnare una struttura che consiste di una parete esterna che circonda la struttura che si intende aver eluito via e riempito. Stampare la struttura con poloxamer. La stampa della parete prenderà 6 min.

Attenzione: La parete deve essere stampato almeno 3,5 mm dalla struttura interna a causa delle dimensioni del dell'ago. Altrimenti la stampa della parete esterna distruggerà la struttura interna

  1. Preparare la soluzione che si desidera per riempire il vostro sacrificial con stampo (qui di agarosio 1% in acqua deionizzata). La soluzione di agarosio deve avere una temperatura compresa tra 35 ° C e 45 ° C. Sotto questa temperatura, l'agarosio solidificherà troppo velocemente; sopra di questa temperatura, potrebbe distruggere i pilastri stampati perché la struttura polossamero ammorbidirà.
  2. Lentamente riempire lo stampo con la soluzione sacrificale riempimento mediante pipetta. Questo dovrebbe essere fatto lentamente per evitare la distruzione della struttura all'interno della parete.
  3. Lasciate che il gel soluzione ripiena o reticolarlo seconda del polimero utilizzato. Nel caso di agarosio della solidificazione avvenuta a 4 ° C per 10 min.
  4. Mettere lo stampo sacrificale ripiena in un bagno di ghiaccio per 10 minuti per eluire la struttura poloxamer.
  5. Asciugare la struttura ripiena con un fazzoletto di carta e metterlo su un nuovo vetrino da microscopio. Premere attentamente la struttura sul vetrino per microscopio per evitare perdite del terzo idrogel dal vuoto nello spazio trala struttura ripiena e il vetrino per microscopio.

5. Riempimento dei vuoti

  1. Per riempire i vuoti lasciati dal poloxamer eluito, riempire la soluzione di polimero prevista in una siringa dotata di un ago G 30. In questo esempio, abbiamo usato un alginato metacrilato 1% in soluzione di NaCl 0,15 M con l'aggiunta di 0,05% w / v litio fenil-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) e 2,5% v / v di Alexa-488 fibrinogeno coniugato . La Alexa-488 fibrinogeno coniugato è stato aggiunto per scopi di visualizzazione.
  2. Photopolymerize il polimero con una lampada UV ad alta intensità (100 Watt, 365 nm, la distanza dal substrato è stata del 3,5 cm) per 5 minuti e il costrutto immagine usando un microscopio a fluorescenza o confocale.

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Risultati

I risultati rappresentativi mostrano che la tecnica dello stampo inverso (illustrato nella figura 2) creerà un gel strutturato che può essere riempito con un secondo materiale. All'inizio di ogni processo di stampa, i parametri di stampa sono prima ottimizzati. Regolazioni fasi dell'attuale parametri provocheranno costrutti stampati multistrato rappresentati in Figura 3 e Figura 4 quando singole linee vengono stampate. Se lo spessore dello strato (l'ascensor...

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Discussione

Presentiamo qui, per la prima volta, l'uso di un polimero termosensibile per uno stampo sacrificale che può essere rapidamente eluita in acqua fredda a causa del gel-sol transizione di poloxamer di ~ 20 ° C. La velocità dell'intero processo rende polossamero interessante per la rapida creazione di strutture biopolimero che non può essere stampato con una risoluzione adeguata. La tecnica qui descritta può essere utilizzata per patterning un idrogel idrogel all'interno di un altro o per la creazione di canali ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Deborah Studer per l'aiuto con il bioprinter.

Il lavoro è stato finanziato dal Programma dell'Unione Europea Settimo programma quadro (FP7/2007-2013) convenzione di sovvenzione n ° NMP4-SL-2009-229.292.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
REAGENTS
Poloxamer (Pluronic F127)SigmaP2443
PBSInvitrogen10010-015
CAD softwareregenHUBioCAD
Alginato metacrilatoInnovent e.V Technologieentwicklung JenaSintetizzato da Innovent per il progetto FP7 Nr NMP4-SL-2009-229292
Fibrinogeno da plasma umano, Alexa Fluor 488 coniugatoInvitrogenF13191
Litio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP)Innovent e.V Technologieentwicklung JenaSintetizzato da Innovent per il progetto FP7 Nr NMP4-SL-2009-229292
AgaroseLonza50004
EQUIPMENT
BioprinterregenHUBiofactory
ValveregenHUμ m Nozzel Diametro
AgoregenHU150 μ m Diametro interno
Zeiss Axioobserver con ApoTomeZeiss
Sorgente di luce UVUVPB-100AP Lampada UV ad alta intensità100 W

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